[發(fā)明專利]一種TALE重復(fù)序列載體的構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610266044.8
• 申請日: 2016-04-26
• 公開（公告）號: CN107312788B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王崧;胡寶洋
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院動物研究所
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 北京泛華偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11280
• 代理人: 李渤;郭廣迅

1.一種構(gòu)建TALE重復(fù)序列載體的方法，其特征在于，所述方法包括：

1）以含有TALE二聚體的核苷酸序列為模板進行PCR擴增；

2）以BsaI酶切步驟1）得到的擴增產(chǎn)物，將所述酶切獲得的含TALE的片段連接形成TALEN重復(fù)序列載體；

其中，步驟1）中所述TALE二聚體的單體具有如SEQ ID NO:1所示的通式：

SEQ ID NO:1 LTPEQVVAIASX₁X₂GGKQALETVQRLLPVLCQX₃HG；

其中，X₁X₂選自NH、NI、HD和NG中的一個組合；X₃為A或D；其中，所述二聚體單體中的一個X₃為A，另一個X₃為D；

其中，步驟2）是通過包括下述步驟的方法實現(xiàn)的：

將步驟1）中得到的PCR回收片段、TALEN骨架載體、BsaI酶、DNA連接酶、CutSmart緩沖液、ATP混勻，置于PCR儀中反應(yīng)；每一種PCR回收片段與TALEN骨架載體的質(zhì)量比為1：10。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，編碼所述單體的核苷酸序列為SEQ ID NO:2。

3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含有TALE二聚體的序列是通過包含下述步驟的方法得到的：

首先，以包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列為模板，使用引物F9/R9和F10/R10分別用Q5DNA聚合酶PCR擴增得到第一個TALE單體和第二個TALE單體；然后使用引物F9/R10通過重疊PCR將所述第一個和第二個TALE單體拼接起來；其中，所述引物F9為SEQ ID NO:19； 引物R9為SEQ ID NO:20；引物F10為SEQ ID NO:21；引物R10為SEQ ID NO:22 。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1）中PCR所使用的二聚體擴增引物選自下述組合中一組或多組：

以SEQ ID NO:3為上游引物，SEQ ID NO:4為下游引物；

以SEQ ID NO:5為上游引物，SEQ ID NO:6為下游引物；

以SEQ ID NO:7為上游引物，SEQ ID NO:8為下游引物；

以SEQ ID NO:9為上游引物，SEQ ID NO:10為下游引物；

以SEQ ID NO:11為上游引物，SEQ ID NO:12為下游引物；

以SEQ ID NO:13為上游引物，SEQ ID NO:14為下游引物；

以SEQ ID NO:15為上游引物，SEQ ID NO:16為下游引物；

或以SEQ ID NO:17為上游引物，SEQ ID NO:18為下游引物。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1）中，二聚體擴增的反應(yīng)條件為：

98℃反應(yīng)30秒，98℃反應(yīng)10秒, 55℃反應(yīng)10秒, 72℃反應(yīng)20秒；30個循環(huán)后，72℃延伸2min, 產(chǎn)物于4℃保存。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2）中所述PCR反應(yīng)條件為：37℃反應(yīng)5分鐘，20℃反應(yīng)5分鐘，20個循環(huán)；50℃反應(yīng)5分鐘，80℃反應(yīng)5分鐘。

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述TALEN骨架載體選自pTALEN-NI、pTALEN-NN、pTALEN-NG或pTALEN-HD。

8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述DNA連接酶為T4連接酶或T7連接酶。

9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR回收片段為多種不同的片段。

10.一種含有TALE二聚體的質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒是通過包括下述步驟的方法得到的：

首先，以SEQ ID NO:2為模板，使用引物F9/R9和F10/R10分別用Q5 DNA聚合酶PCR擴增得到第一個TALE單體和第二個TALE單體；然后使用引物F9/R10通過重疊PCR將所述第一個和第二個TALE單體拼接起來；然后，通過EcoRⅠ/BamHⅠ酶切，得到TALE二聚體單元；最后，將所述TALE二聚體單元克隆到pEGFP-N1載體中，即得；其中，所述引物F9為SEQ ID NO:19 ;引物R9為SEQ ID NO:20; 引物F10為SEQ ID NO:21 ；引物R10為SEQ ID NO:22。