[發明專利]一種用于高通量測序檢測的腫瘤基因變異文庫的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 201610264349.5
• 申請日: 2016-04-26
• 公開（公告）號: CN107312822A
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發明（設計）人: 陳琰;郭飛飛
• 申請（專利權）人: 廈門飛朔生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B50/06
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司35204
• 代理人: 張松亭,姜謐

技術領域

本發明具體涉及一種用于高通量測序檢測的腫瘤基因變異文庫的構建方法及其應用。

背景技術

2015年中國預計有429.2萬例新發腫瘤病例和281.4萬例死亡病例。肺癌是發病率最高的腫瘤，也是癌癥死因之首。胃癌、食管癌和肝癌是緊隨其后的我國發病率和死亡率較高的常見腫瘤。

癌癥治療傳統的方法有手術、化療、放療。隨著醫學技術的進步，靶向藥物治療中晚期肺癌越來越成為一條新路，其中的治療也根據疾病類型各不相同。對不同驅動基因類型的癌癥患者，在治療上一定要區別對待。存在有靶點的患者，可優先采用靶向治療。靶向治療和化療是完全不同的治療措施，有很多的機制參與腫瘤的發病，而這些機制往往是腫瘤細胞所特有的，所謂的靶向治療就是阻斷腫瘤發病機制當中特有的信號傳導通路，或者某一分子發病機制，從而達到扼殺腫瘤的目的。因此靶向治療能顯著減少患者的不良反應，提高患者的生活質量。

目前具有明確指導意義的靶點部分信息如下：

EGFR基因：EGFR基因位于染色體7p22-p12上。表皮細胞生長因子受體(EGFR)及其配體是影響不同細胞功能的細胞信號分子，包括細胞增殖、分化、遷移和生存，并影響組織生長。EGFR(表皮生長因子受體)分子有3個部分：第一個部分延伸在細胞外，包括結合表皮生長因子(EGF)的位點；第二部分嵌入細胞膜中；第三部分延伸至細胞內的細胞質中。EGFR是一種由相連的磷酸化酪氨酸殘基組成的蛋白質激酶。

EGFR是一種跨膜受體酪氨酸激酶，該區域的激活即磷酸化對癌細胞增值、生長的相關信號傳遞具有重要意義。因此，EGFR作為癌癥治療的分子靶標受體普遍關注，并陸續開發出了吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)和埃克替尼(icotinib)等EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)和抗EGFR抗體等。

大量研究結果顯示，EGFR基因突變狀態是決定EGFR-TKI療效最重要的預測因子。而EGFR基因突變的發生率在女性、非吸煙者、腺癌、亞裔人群中發生頻率較高。EGFR基因突變的發生率雖然在腺癌中較高，但在未分化腺癌、腺鱗癌、小細胞癌(尤其是與腺癌的復合型)等患者中也經常可以檢測到EGFR基因的突變。

在非小細胞肺癌患者中檢測EGFR基因的突變狀態具有重要的臨床意義，是決定患者是否能夠應用EGFR-TKI治療的先決條件。

K-ras基因：K-ras基因長約38Kb，帶有4個外顯子，其中外顯子4具有2種轉錄形式，分別為4A和4B。隨后研究發現K-ras基因總共帶有6個外顯子，外顯子2、3、4是保守不變的外顯子編碼區，外顯子5在轉錄時有可能發生拼接而形成K-ras B蛋白。在K-ras A的轉錄mRNA中外顯子6編碼3端非編碼區，而在K-ras的轉錄mRNA中外顯子6編碼碳端區域。

在細胞增殖分化信號從激活的跨膜受體傳遞到下游蛋白激酶的過程中K-ras起重要作用。ras蛋白為膜結合型的三磷酸鳥苷(GTP)P二磷酸鳥苷(GDP)結合蛋白，相對分子質量21×103，又稱為p21蛋白，以兩種形式存在于細胞膜內表面，活性形式p21-GTP，非活性形式為p21-GDP，當p21蛋白受一些影響細胞生長，發育，分化的因子誘導激活后，就將細胞膜表面的信號，如生長因子、激素、神經遞質等轉遞到細胞內效應器上，同時自身受由縫隙控制的GTPase水解，從活性狀態恢復到非活性狀態。通過Ras信號轉導通路，激活下游信號分子，持續刺激細胞生長、發育、增殖，引起細胞惡變。