[發(fā)明專利]一種用于高通量測序檢測的腫瘤基因變異文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610264349.5
• 申請日: 2016-04-26
• 公開（公告）號: CN107312822A
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳琰;郭飛飛
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門飛朔生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B50/06
• 代理公司: 廈門市首創(chuàng)君合專利事務(wù)所有限公司35204
• 代理人: 張松亭,姜謐

1.一種用于高通量測序檢測的腫瘤基因變異文庫的構(gòu)建方法，其特征在于：覆蓋人類基因EGFR、K-ras、B-raf、PIK3CA、N-ras、c-MET、AKT1、HER2、c-KIT、PDGFRA、ALK-EML4、ROS1和RET上的總共389種體細(xì)胞突變，具體包括如下步驟：

(1)針對目的基因EGFR、K-ras、B-raf、PIK3CA、N-ras、c-MET、AKT1、HER2、c-KIT和PDGFRA設(shè)計第一基本擴(kuò)增引物組，該第一基本擴(kuò)增引物組的正向引物和反向引物的5’端設(shè)有額外的2～5個T，且該2～5個T的靠近3’端的第一個T具有PNA修飾，同時該第一基本擴(kuò)增引物組的Tm值相差不超過1℃；

(2)針對目的基因ALK-EML4、ROS1和RET的融合突變設(shè)計第二基本擴(kuò)增引物組，該第二基本擴(kuò)增引物組的正向引物和反向引物的5’端設(shè)有額外的2～5個T，且該2～5個T的靠近3’端的第一個T具有PNA修飾，同時該若干對第一基本擴(kuò)增引物的Tm值相差不超過1℃；

(3)設(shè)計對應(yīng)第一基本擴(kuò)增引物組的第一不對稱連接探針組、對應(yīng)第二基本擴(kuò)增引物組的第二不對稱連接探針組與一不與人類基因組形成互補(bǔ)的通用引物，第一不對稱連接探針組含有多對不同的第一不對稱連接探針，第二不對稱連接探針組含有多對不同的第二不對稱連接探針，每對第一不對稱連接探針和每對第二不對稱連接探針均包括可自身形成環(huán)狀的一正向探針和一反向探針，該正向探針和反向探針從3’端至5’端均依次包括一能夠與不對稱連接探針的5’端若干連續(xù)堿基配對的互補(bǔ)序列、一與所述通用引物互補(bǔ)配對的擴(kuò)增序列和一與上述2～5個T相對應(yīng)的粘性末端識別序列，同時各正向探針和反向探針均具有相應(yīng)的標(biāo)簽序列，上述每對不對稱連接探針的正向探針和反向探針的Tm值相差不超過1℃；

(4)將模板、上述第一基本擴(kuò)增引物組置于一含有RingCap-Taq酶的第一PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，純化后得第一擴(kuò)增產(chǎn)物；將第一擴(kuò)增產(chǎn)物、第一不對稱連接探針組、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合進(jìn)行PCR，純化后獲得第一文庫產(chǎn)物；

(5)將模板、上述第二基本擴(kuò)增引物組置于一含有RingCap-Taq酶的第二PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，純化后得第二擴(kuò)增引物；將第二擴(kuò)增產(chǎn)物、第二不對稱連接探針組、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合進(jìn)行PCR，純化后獲得第二文庫產(chǎn)物；

(6)將第一文庫產(chǎn)物和第二文庫產(chǎn)物組成所述用于高通量測序的腫瘤基因變異文庫；

上述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA連接酶和DNA末端修飾酶組成。

2.如權(quán)利要求1所述的一種用于高通量測序檢測的腫瘤基因變異文庫的構(gòu)建方法，其特征在于：所述目的基因EGFR具體為EGFR基因的18、19、20和21外顯子，目的基因K-ras具體為K-ras基因外顯子2、3和4，目的基因B-raf具體為B-raf基因的外顯子15，目的基因PIK3CA具體為PIK3CA基因的外顯子9和20，目的基因N-ras具體為N-ras基因的2、3和4，目的基因c-MET具體為c-MET基因的外顯子2、14、16和19，目的基因AKT1具體為AKT1基因的外顯子3，目的基因HER2具體為HER2基因的外顯子19、20和21,，目的基因c-KIT具體為c-KIT基因的外顯子9、11、13和17，目的基因PDGFRA具體為PDGFRA基因的外顯子16和18。