[發明專利]利用截短柔性殘基提高普魯蘭酶催化性能的方法

有效

• 申請號: 201610259979.3
• 申請日: 2016-04-25
• 公開（公告）號: CN105734034B
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 聶堯;徐巖
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/44
• 分類號: C12N9/44;C12N15/56;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 耿曉岳

本發明公開了利用截短柔性殘基提高普魯蘭酶催化性能的方法，屬于酶工程技術領域。本發明通過去除Bacillus naganoensis JNB?1普魯蘭酶的氨基酸序列的N端的前5、22、45、64、78、106位氨基酸以及C端的后9、36位氨基酸，獲得的所有突變酶的K_m值都降低了，說明截短提高了酶與底物的親和力；此外PulΔN5和PulΔN106的酶活分別比野生酶提高了42％、17％，PulΔN5、PulΔN106、PulΔC9的比活力分別比野生酶提高了21％、15％，PulΔN5、PulΔN78、PulΔC9的半衰期分別比野生型提高了10h、12h、24h，PulΔN5、N45、PulΔN78、PulΔN106和PulΔC9的k_cat/K_m值提高，說明突變酶擁有更高的催化效率。本發明的普魯蘭酶更適合工業應用。

技術領域

本發明涉及利用截短柔性殘基提高普魯蘭酶催化性能的方法，屬于酶工程技術領域。

背景技術

普魯蘭酶是解支酶的一種，能水解的最小底物只需兩條由α-1,6糖苷鍵連接的含有兩個由α-1,4糖苷鍵連接的葡萄糖鏈段。由于淀粉結構的復雜性，在淀粉解聚為低聚糖或小分子單糖的過程中必須由多種酶協同作用。在淀粉糖化過程中，由于糖化酶對α-1,6糖苷鍵的作用有限，因此目前雙酶法生產淀粉糖制品的最高轉化率只能達到96％。如果在糖化過程中添加普魯蘭酶與糖化酶協同作用，則可將轉化率提高到97％以上，并提高生產效率，降低生產成本。

I型普魯蘭酶是糖苷水解酶13家族的成員之一，該家族成員的主要的催化部位由四個結構域A、B、C、F構成。結構域A是由8個β-折疊、8個α-螺旋構成的中央催化的(β/α)₈折疊桶結構，該區域包含了催化三聯體(Asp,Asp,Glu)。較小的結構域B插入(β/α)₈折疊桶的第三個β-折疊和第三個α-螺旋的中間，活性口袋正位于該結構域，且(vβ/α)₈折疊桶桶壁也由該結構域構成。由8個β-折疊形成希臘鑰匙拓撲結構是結構域C的特征性結構。而F結構域由一個小的a螺旋和6個β-折疊，折疊形成的β三明治基序的β-反平行片層。結構域A的C端和N端分別連接著結構域C和結構域F。

1943年首次報道普魯蘭酶，1991年Tomimura從長野芽胞桿菌(B.naganoensis，ATCC No.53909)中分離出了普魯蘭酶。到目前為止，已經從芽孢桿菌、產氣氣桿菌、放線菌，鏈球菌、鏈霉及一些嗜熱菌中發現普魯蘭酶，不同來源的普魯蘭酶，酶學性質也各有不同。由于糖化酶的作用條件具有高溫(55℃–65℃)和弱酸性(pH 4.5–5.5)的特點，所以大多數天然的普魯蘭酶的酶學性質限制了其在工業生產中的應用。

因此，改善普魯蘭酶的酶學性質以擴寬其在工業生產中的應用，是目前亟需解決的問題。

發明內容

為了克服上述問題，本發明提供了一種利用截短柔性殘基提高普魯蘭酶催化性能的方法，并提供了一種普魯蘭酶突變體，所述突變體的氨基酸序列相對于Bacillusnaganoensis來源的普魯蘭酶的氨基酸序列，發生了N端或C端柔性區域的截短。

在本發明的一種實施方式中，所述截短是指截去N端的前5個、22個、45個、64個、78個或106個氨基酸(分別命名為PulΔN5、PulΔN22、PulΔN45、PulΔN64、PulΔN78、PulΔN106)，或者是截去C端的最后9個或最后36個氨基酸(分別命名為PulΔC9、PulΔC36)。

在本發明的一種實施方式中，所述Bacillus naganoensis來源的普魯蘭酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示(按N端-C端的順序)。

在本發明的一種實施方式中，所述Bacillus naganoensis來源的普魯蘭酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。