[發明專利]適合代謝組學水牛胚胎培養及檢測胚胎發育潛能的方法

在審

• 申請號: 201610259350.9
• 申請日: 2016-04-25
• 公開（公告）號: CN106635963A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 陸陽清;許惠艷;盧克煥;朱平川
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;G01N30/02
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明屬于水牛胚胎培養及檢測技術領域，尤其涉及一種適合代謝組學水牛胚胎培養及檢測胚胎發育潛能的方法。

背景技術

代謝組學是研究細胞和生物體的所有代謝中間體和終產物的一門新興科學，相對于DNA或蛋白質等生物高分子而言，代謝組學的研究對象一股為分子質量在1000Da以下的小分子。由于代謝網絡處于基因調控、信號傳導及蛋白質互作網絡的下游，因此代謝組學研究反映了基因組、轉錄組和蛋白質組受內外環境影響下相互協調作用的最終結果，代謝組學的研究更接近于細胞或生物的表型。代謝組的功能和代謝組學的重要性使代謝組學成為生物學中繼基因組學、轉錄組學、蛋白質組學后的又一個重要的組學平臺，被廣泛地應用于醫學、藥學、微生物學、環境學和食品科學等生命科學的各個研究領域。

代謝組學具有如下特點：首先，與細胞或機體的基因和蛋白質相比，代謝物數量顯著少，人類基因組大約包含2.5萬個基因，編碼10萬～20萬個轉錄子，翻譯100萬種蛋白質，卻僅產生2500～3000種代謝物，故代謝組檢測要比轉錄組或蛋白組檢測簡單廉價。其次，轉錄組及蛋白組的改變并不總是與細胞表型相關，而代謝物組是基因表達的終產物，反應了細胞的真實功能狀態，可較前者更準確地評估基因功能。最后，基因過度表達等微小變化經轉錄組和蛋白組逐級放大后，在代謝物水平上更易被檢測。

胚胎質量的優劣直接關系到胚胎移植后妊娠效率。目前對胚胎質量的評估中，應用最為廣泛的是對胚胎發育時期各階段的形態特征進行評分。近年來在形態學結合實時成像分析系統對胚胎發育過程進行連續觀察并對其進行選擇，但卻無具體的數值標準來判定，且容易受觀察者主觀影響。而通過檢測胚胎培養基中代謝物的代謝組學方法可更有效地分析胚胎活性，有效地反映細胞發育情況，預測胚胎發育的最終結果，對提高胚胎附植率將有重要的意義。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種適合代謝組學水牛胚胎培養及檢測胚胎發育潛能的方法，該法可為胚胎生產中的胚胎移植前胚胎質量提供判斷依據。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：適合代謝組學的水牛胚胎培養方法，第一步，取未成熟的水牛卵母細胞，經體外成熟、體外受精后獲得假定受精胚胎進行群體 培養；第二步，待胚胎發育到囊胚階段，進行單胚胎培養。

上述適合代謝組學的水牛胚胎培養方法，按以下操作進行：取未成熟的水牛卵母細胞進行體外成熟，將體外成熟的卵子經體外受精后，把假定受精胚胎放到共培養液體系中，微滴群體培養；待胚胎發育到囊胚階段，用撿卵針撿出囊胚，用PBS溶液洗滌1-2次，放入事先在培養箱中平衡2h以上的20μl蓋油的SOF液(SOF液成分參照Carolant et al.，1995，Theriogenology 43：1115-l 128)培養，每個胚胎一滴，于培養箱中繼續培養5-6h后，收集代謝液到200μl的EP管中-80℃凍存。

檢測水牛胚胎發育潛能的方法，按上述培養方法進行培養，單胚胎培養后收集代謝液；通過LC/MS檢測囊胚代謝液成分，通過PCA數據分析鑒定胚胎發育能力。

代謝液按以下操作進行預處理：首先把樣品從-80℃冰箱中，放入冰面上解凍，然后用超純水預洗滌一次膜的Merck Millipore離心過濾管，4度12000g.min^-1離心15min。

LC/MS檢測條件及參數按以下設置：

選擇前用乙晴沖洗柱子15min，用95％的0.1％甲酸水平衡柱子15min；

選擇方法：液相，A相0.1％甲酸水，B相100％乙腈；其中，

0-2min 5％乙腈，

2-20min 5％乙腈-95％乙腈，

20min-23min 100％乙晴，

23min-23.1min 5％乙晴，

23.1min-25min 5％乙晴，

流速為0.30mL/min；進樣量：2μL；

一級質譜參數：

二級質譜參數：

HEST SOURCE參數：