[發明專利]一種豬細環病毒1型環介導等溫擴增試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201610259272.2
• 申請日: 2016-04-25
• 公開（公告）號: CN105779655A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 何穎;陳忠偉;趙武;秦毅斌;盧冰霞;李斌;段群棚;周英寧;梁家幸;楊思儀;蔣冬福;蘇乾蓮
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李彥孚;何承鑫

技術領域

本發明涉及微生物檢測技術領域，具體說是涉及一種快速、可視化并且可實時定 量檢測豬細環病毒1型的環介導等溫擴增試劑盒及其應用。

背景技術

豬細環病毒(Torquetenosusvirus,TTSuV)是一種無囊膜，單股負鏈的環形 DNA病毒，根據其核苷酸序列差異可將TTSuV分為兩個亞型即TTSuV1和TTSuV2，都屬于指 環病毒科(Anelloviridae)，壬型指環病毒屬(Iotatorquevirus)，由日本學者 Nishizawa等于1997年在輸血后的肝炎患者的血清中發現。但TTV宿主范圍非常廣泛，除 了能感染常見的家禽家畜外，也能感染包括人和其他靈長類動物。不同年齡段的豬群均對 豬細環病毒(Torquetenosusvirus，TTSuV)易感，我國豬群感染率大致在24%～100%， 其中根據王礞礞等于2008～2009年間采集了來自中國6個省市的發病豬和健康豬樣本的 檢測結果顯示，TTSuV1感染率約為37.6％，TTSuV2感染率約為82.6％，二者混合感染率為 38.4％。到現今為止，人們仍不清楚TTSuV的致病性，目前研究只了解到TTSuV與豬繁殖呼 吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環病毒(PCV)等病毒存在某種協同作用，當發生混合感染 時會加重斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)和豬皮炎腎病綜合癥的癥狀。

對豬細環病毒1型的密切監測和快速診斷，有利于該病及其他協同感染疾病的防 治。當前，可通過常規PCR、熒光定量PCR、和套式PCR等技術手段來檢測TTSuV1的存在，但 這些技術在運用上尚存在著一些不足，并且對硬件方面有較高要求，在結果判定上還需進 行瓊脂糖凝膠電泳，容易造成實驗室污染導致出現假陽性結果，用時也較長，不適合基層和 現場檢測。因此建立一種簡單且靈敏的TTSuV1檢測方法，具有一定的臨床意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種為基層簡便、快捷準確地檢測豬細環病毒1型的方法，公 開一種快速、實時定量的檢測豬細環病毒1型環介導等溫擴增試劑盒。為實現本發明目的所 使用的技術方案為：一種豬細環病毒1型環介導等溫擴增試劑盒，該試劑盒包括TTSuV1- LAMP引物、2×反應緩沖液、BstDNA聚合酶、熒光目視檢測試劑、超純水和TTSuV1-DNA模板， 所述的TTSuV1-LAMP引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）與B3（SEQIDNO：2）、內引物FIP（SEQ IDNO：3）與BIP（SEQIDNO：4）和環引物LF（SEQIDNO：5）與LB（SEQIDNO：6）；

其中引物的序列分別為：

F3AAGACCCCGCCAAGGTAC

B3CACTGCTCGTGCTTGAGAT

FIPTGTGGGGAGTTCGAGCAGTCTTCAGTCCTCAACCCTTGGGA

BIPGGAGGAGACGGAGAAGGCGTGCTCTCTTCGTCGGAGTCT

LFGTTCTAACAATCCTGTCACAGTCAT

LBACCCACTCCTTGGACAAAAGA

所述的2×反應緩沖液包括Tris-HCL、KCL、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、Betaine和 dNTPs。

所述的豬細環病毒1型DNA模板，是使用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取的疑 似感染豬細環病毒1型的臨床病變組織中的基因組DNA。

所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素熒光試劑，熒光試劑在反應前加入。

所述的2×反應緩沖液包括Tris-HCL35-55mM、KCL10-30mM、MgSO₄15-28mM、 (NH₄)₂SO₄18-28mM、Tween200.5-1.5℅、Betaine1.3-3.5M和dNTPs2.4-4.8mM，其配制 方法在pH為8.6左右條件下，將上述溶劑混合均勻獲得。

一種豬細環病毒1型環介導等溫擴增試劑盒的應用，獸醫臨床上用于檢測疑似豬 細環病毒1型病變組織或培養物中是否含有豬細環病毒1型，具體檢測步驟包括：

（1）LAMP引物的設計與合成