[發(fā)明專利]一種基因組目標(biāo)區(qū)域測(cè)序的雜交捕獲方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610258573.3
• 申請(qǐng)日: 2016-04-22
• 公開（公告）號(hào): CN107304448B
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張彥偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 張彥偉
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869
• 代理公司: 北京智為時(shí)代知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

本發(fā)明提供了一種基因組目標(biāo)區(qū)域測(cè)序的雜交捕獲方法，包括引物設(shè)計(jì)合成、文庫(kù)構(gòu)建和雜交捕獲步驟，對(duì)雜交捕獲進(jìn)行了優(yōu)化，操作簡(jiǎn)單，孵育時(shí)間適中，能夠用于多種不同來(lái)源的DNA文庫(kù)，有效降低捕獲成本，提高捕獲效率，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，適合基因組目標(biāo)區(qū)域的測(cè)序。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因測(cè)序領(lǐng)域，具體涉及一種基因組目標(biāo)區(qū)域測(cè)序的雜交捕獲方法。

背景技術(shù)

在二代測(cè)序中，常需要對(duì)特定基因組目標(biāo)區(qū)域測(cè)序。目標(biāo)區(qū)域測(cè)序，比較常用的方法利用RNA探針捕獲富集感興趣的目標(biāo)基因或基因組區(qū)域的DNA片段，以提高測(cè)序的深度、準(zhǔn)確性和靈敏度。

由于DNA捕獲探針被設(shè)計(jì)成能夠與靶標(biāo)區(qū)域相雜交互補(bǔ)的性質(zhì)，使得目標(biāo)片段的富集依賴于核苷酸的物理及化學(xué)性質(zhì)，比如二級(jí)結(jié)構(gòu)、退火溫度、核苷酸濃度以及GC含量及鹽濃度等。

基于雜交富集的原理，通常通過(guò)提高孵育的時(shí)間來(lái)提高特異性，通常的孵育時(shí)間在10-72小時(shí)，甚至更長(zhǎng)。而長(zhǎng)時(shí)間的孵育明顯影響測(cè)序的進(jìn)程。另外，較高的孵育溫度以及長(zhǎng)時(shí)間的孵育將會(huì)影響混合液中的鹽離子濃度，尤其是當(dāng)雜交反應(yīng)的體積較小的時(shí)候。

雖然現(xiàn)在很多測(cè)序公司已經(jīng)能夠提供商品化的雜交富集方法及相應(yīng)的試劑盒，但是其雜交方法多針對(duì)于本公司所生產(chǎn)的探針，其捕獲探針通常不公開，且試劑溶液價(jià)格昂貴。每種試劑盒的操作條件均不相同，存在較大的差異，且文庫(kù)的輸入量有嚴(yán)格要求。

因而很有必要提供一種重復(fù)性高，操作時(shí)間短，高特異性，同時(shí)能夠適用多種方法構(gòu)建的基因組文庫(kù)及捕獲探針的雜交溶液及方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中雜交富集溶液昂貴、使用有局限，提供一種用于基因組目標(biāo)區(qū)域測(cè)序的雜交捕獲方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種基因組目標(biāo)區(qū)域測(cè)序的雜交捕獲方法，包括如下步驟：

(一)探針設(shè)計(jì)合成

根據(jù)基因組目標(biāo)區(qū)域，以已知基因組序列為參考，以瓦片陣列的方式設(shè)計(jì)生成探針群，探針長(zhǎng)度為100～120bp，并過(guò)濾掉高度重復(fù)探針，在探針兩段加入通用引物，并合成作為探針模板，以此模板體外轉(zhuǎn)錄制備參入生物素標(biāo)記核苷酸的探針；

(二)文庫(kù)構(gòu)建

按照插入片段大小為200～300bp構(gòu)建DNA文庫(kù)，文庫(kù)濃度不低于15ng/μl；

(三)雜交捕獲

1)分別配置文庫(kù)混合液、雜交混合液和捕獲混合液；

2)PCR儀設(shè)定如下程序：95℃，5min；65℃，3min；65℃，2min；65℃，∞；

3)放入文庫(kù)混合液，開始程序第一步：95℃5min；

4)到程序第二步65℃3min時(shí)，立即將雜交混合液放入；

5)到程序第三步65℃2min時(shí)，立即將捕獲混合液放入；

6)到程序第四步后，在PCR儀上，將文庫(kù)混合液、雜交混合液與捕獲混合液混合；

7)65度雜交36個(gè)小時(shí)；

8)用磁珠捕獲步驟7)的雜交產(chǎn)物；

其中，文庫(kù)混合液含Human cot-1、通用寡核苷酸、步驟(二)構(gòu)建的文庫(kù)和文庫(kù)對(duì)應(yīng)的blocker序列；其中，雜交混合液由SSPE、EDTA、Denharts溶液及SDS混合制成；其中，捕獲混合液為含步驟(一)所述探針和RNase抑制劑的溶液。

其中，步驟(二)構(gòu)建文庫(kù)進(jìn)行的PCR循環(huán)數(shù)不超過(guò)9次，構(gòu)建文庫(kù)時(shí)包括采用Ampure磁珠對(duì)打斷產(chǎn)物純化的步驟。