[發(fā)明專利]一種基因組目標(biāo)區(qū)域測序的雜交捕獲方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610258573.3
• 申請日: 2016-04-22
• 公開（公告）號: CN107304448B
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張彥偉
• 申請（專利權(quán)）人: 張彥偉
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京智為時代知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

1.一種基因組目標(biāo)區(qū)域測序的雜交捕獲方法，其特征在于，包括如下步驟：

(一)探針設(shè)計合成

根據(jù)基因組目標(biāo)區(qū)域，以已知基因組序列為參考，以瓦片陣列的方式設(shè)計生成探針群，探針長度為100～120bp，并過濾掉高度重復(fù)探針，在探針兩端加入通用引物，并合成作為探針模板，以此模板體外轉(zhuǎn)錄制備參入生物素標(biāo)記核苷酸的探針；

(二)文庫構(gòu)建

按照插入片段大小為200～300bp構(gòu)建DNA文庫，文庫濃度不低于15ng/μl；

(三)雜交捕獲

1)分別配置文庫混合液、雜交混合液和捕獲混合液；

2)PCR儀設(shè)定如下程序：95℃，5min；65℃，3min；65℃，2min；65℃，∞；

3)放入文庫混合液，開始程序第一步：95℃5min；

4)到程序第二步65℃3min時，立即將雜交混合液放入；

5)到程序第三步65℃2min時，立即將捕獲混合液放入；

6)到程序第四步后，在PCR儀上，將文庫混合液、雜交混合液與捕獲混合液混合；

7)65℃雜交36個小時；

8)用磁珠捕獲步驟7)的雜交產(chǎn)物；

其中，文庫混合液含Human cot-1、通用寡核苷酸、步驟(二)構(gòu)建的文庫和文庫對應(yīng)的blocker序列

其中，雜交混合液由SSPE、EDTA、Denharts溶液及SDS混合制成；其中，捕獲混合液為含步驟(一)所述探針和RNase抑制劑的溶液；其中，雜交混合液的的具體配置為：4*SSPE 20μl、pH 8.0、0.1M EDTA0.8μl、50×Denharts 8μl、0.1％SDS 8μl。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交捕獲方法，其特征在于，其中步驟(二)構(gòu)建文庫進(jìn)行的PCR循環(huán)數(shù)不超過9次。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交捕獲方法，其特征在于，所述文庫混合液的配置方法如下：在1.5mLEP管中加入：Human cot-1 5μl、500μM Universal oligo 2μl、1-8種DNA文庫每個文庫200ng，各DNA文庫對應(yīng)的blocker 200μM各1μl，蓋上后，用注射器針頭在蓋上扎3-5個孔，65℃離心真空干燥至看不見明顯液滴，12000rpm離心2min，打開蓋，底部加入8μl水，蓋上蓋，用封口膜將蓋子上的孔封住，渦旋，12000，2min，并轉(zhuǎn)移到PCR管。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交捕獲方法，其特征在于，所述捕獲混合液的配置方法如下：步驟(一)所述探針5μl、RNase抑制劑1μl。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交捕獲方法，其特征在于，所述步驟(三)第6)步為到程序第四步后，在PCR以上，移7μl文庫混合液與13μl雜交混合液至捕獲混合液，上下吹吸10次。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交捕獲方法，其特征在于，所述的blocker選自SEQ IDNO.1-96所示的序列。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交捕獲方法，其特征在于，其中步驟(二)構(gòu)建文庫時包括采用Ampure磁珠對打斷產(chǎn)物純化的步驟。