[發明專利]一種能增殖和包裝缺失E1基因重組豬3型腺病毒的細胞系及其構建方法

在審

• 申請號: 201610255773.3
• 申請日: 2016-04-23
• 公開（公告）號: CN107304415A
• 公開（公告）日: 2017-10-31
• 發明（設計）人: 張志剛;陳瑞;董劍輝
• 申請（專利權）人: 北京康寶利華生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N7/00;C12R1/91
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技術領域：

本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及一種能增殖和包裝缺失E1基因重組豬3型腺病毒的細胞系及其構建方法，應用于ΔE1 PAV3的口服疫苗和基因遞送系統研究。

背景技術：

豬3型腺病毒（PAV3）為健康豬腸道分離病毒，與目前普遍使用的人5型腺病毒（HAV5）相比，PAV3具有更高的安全性、更強的免疫原性、可口服途徑免疫以及可逃逸機體存在豬腺病毒免疫干擾的諸多優勢。充分發揮PAV3以上優勢的前提是具備缺失E1基因（ΔE1 PAV3）的感染性克隆和高效包裝細胞系。

腺病毒載體（Ad vectors），特別是人腺病毒5型（HAV5）已經廣泛應用于基因治療、疫苗生產和病毒治療領域。目前，用于治療的腺病毒載體大多是復制缺陷型載體，即基因組缺失E1區或E1和E3區都缺失的腺病毒載體，增加改造腺病毒載體外源片段的插入容量。由于E1區在不同腺病毒間無特異性，因此目前通用穩定表達HAV5 E1基因的細胞系來包裝各種一代代非人類腺病毒載體。E3區基因編碼產物功能是對抗宿主機體的防御系統，但是對病毒在體外的復制是非必需的，所以在構建拯救細胞系時也是非必需的。盡管缺失E1和E3區可使腺病毒獲得約9kb的插入容量，但是病毒復制必須基因E1的缺失會導致病毒包裝的失敗。因此，E1缺失的腺病毒需要在穩定表達E1基因的細胞系統中才能拯救。如E1缺失的 HAV5在穩定表達E1基因的293系列細胞中才能拯救出病毒。盡管用HAV5 E1區可以成功拯救多種人腺病毒，但是僅僅依靠HAV5 E1區并不能高效拯救所有E1缺失的腺病毒。其原因在于E1區缺失后，同時會影響到腺病毒E4區的功能，進一步影響到病毒基因組轉錄的起始。盡管HAV-5 E1區的多個ORF無病毒特異性，可用于替代其他腺病毒的E1區的相應區域，但是E1區的E1Blarge具有腺病毒特異性，該特異性主要由E1Blarge與E4區ORF的結合的特異性決定，即只有腺病毒自身的E1Blarge與自身的E4區ORF互作才可啟動高效的病毒基因組轉錄，一旦用其他病毒的E1Blarge替換腺病毒的E1Blarge，E1區缺失腺病毒的拯救效率則會受到很大影響，甚至造成病毒包裝失敗。

目前，腺病毒載體包裝細胞系主要是針對人腺病毒，而拯救缺陷型豬腺病毒的細胞系很少。為了利于缺陷型豬腺病毒載體的改造及其包裝，增加外源片段插入量，構建包裝豬3型腺病毒載體的細胞系尤為重要。此外，VR1BL是目前已知的可以拯救缺失E1區豬3型腺病毒的細胞系。該細胞系是由穩定表達HAV5 E1基因的VIDO R1細胞，經轉入PAV3 E1B Large基因，因為PAV-3 E1B Large基因對豬腺病毒的復制是必須的，所以只有能夠表達PAV3 E1B Large基因的細胞系，才可以實現缺失E1區的PAV3才可以包裝成功。

考慮到野生型 PAV3 除了可在VR1BL中增殖外，還可在豬的睪丸細胞（ST）中高效增殖，本研究基于二代慢病毒包裝系統構建可穩定表達HAV5 E1和PAV3 E1Blarge和I-Sce I 的細胞系——ST-E1-E1Blarge-ISceI。

發明內容：

本發明為了解決上述背景技術中的技術缺陷，提供一種能夠增殖和和包裝缺失E1重組豬3型腺病毒的細胞系，利用此細胞系增殖缺失E1區重組PAV3，可使病毒滴度明顯高于VR1BL細胞；利用該細胞系能夠包裝缺失E1重組PAV3。

本發明提供的能夠增殖和和包裝缺失E1重組豬3型腺病毒的細胞系，命名為ST-E1-E1Blarge-ISceI，保藏編號為：CGMCC NO.12259，保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏時間為：2016年04月08日；分類命名為：豬睪丸細胞。

基于本發明所述的能夠增殖和和包裝缺失E1重組豬3型腺病毒的細胞系能夠增殖缺失E1區重組PAV3，可使病毒滴度明顯高于VR1BL細胞，因此，本發明還請求保護，所述的能夠增殖和和包裝缺失E1重組豬3型腺病毒的細胞系CGMCC NO.12259在增殖缺失E1重組豬3型腺病毒中的應用，以及其在制備豬3型腺病毒疫苗中的應用。

同時，本發明還請求保護一種制備缺失E1基因豬3型腺病毒疫苗的方法，其特征在于，是將缺失E1基因豬3型腺病毒接種至細胞系CGMCC NO.12259上制備得到，以及由該方法制備得到的一種缺失E1基因豬3型腺病毒疫苗。

本發明還提供構建該種能增殖和包裝缺失E1重組豬3型腺病毒的細胞系的方法。

為實現本發明的目的，采用如下技術方案：