[發明專利]一種能增殖和包裝缺失E1基因重組豬3型腺病毒的細胞系及其構建方法

在審

• 申請號: 201610255773.3
• 申請日: 2016-04-23
• 公開（公告）號: CN107304415A
• 公開（公告）日: 2017-10-31
• 發明（設計）人: 張志剛;陳瑞;董劍輝
• 申請（專利權）人: 北京康寶利華生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N7/00;C12R1/91
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種能夠增殖和包裝缺失E1重組豬3型腺病毒的細胞系，命名為ST-E1-E1Blarge-ISceI，保藏編號為：CGMCC NO.12259，保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號 中國科學院微生物研究所，保藏時間為：2016年04月08日。

2.如權利要求1所述的能夠增殖和和包裝缺失E1重組豬3型腺病毒的細胞系CGMCC NO.12259在增殖缺失E1重組豬3型腺病毒中的應用。

3.如權利要求1所述的能夠增殖和和包裝缺失E1重組豬3型腺病毒的細胞系CGMCC NO.12259在制備豬3型腺病毒疫苗中的應用。

4.一種構建權利要求1所述的能增殖和包裝缺失E1基因重組豬3型腺病毒的細胞系的方法,其特征在于，包括以下步驟：(1) 構建表達HAV5 E1的細胞系ST-E1；(2) 構建表達PAV3 E1Blarge和I-SceI的穿梭質粒；(3) 構建穩定表達PAV3 E1Blarge和I-SceI的細胞系ST-E1-E1Blarge-ISceI；(4) 評價穩定表達IsceI/PAV3 E1Blarge基因的ST-E1-E1Blarge-ISceI細胞系。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟（1）中，將含有HAV5 E1基因的載體pTG4671轉染ST細胞，用嘌呤霉素篩選，得到抗嘌呤霉素的ST-E1細胞系。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟（2）中，以本實驗室分離的PAV3基因組為模板，擴增PAV3 E1Blarge基因，通過酶切連接方法，構建中間質粒pCMV-3HA-3NLS-ISceI-2A-PAV3 E1B，通過相應酶切連接方法最終構建成功慢病毒克隆載體。

7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟（3）中，將慢病毒包裝克隆載體與包裝質粒pMD2.G和psPAX2共轉染至293T細胞，收集包裝成功的慢病毒，用293T細胞測定慢病毒的滴度；慢病毒感染ST-E1細胞，用潮霉素篩選得到抗潮霉素的ST-E1-E1Blarge-ISceI細胞系；用Western Blot方法檢測篩選細胞克隆的PAV3 E1Blarge和I-SceI的表達；上述方法得到的細胞系能增殖和包裝缺失E1基因重組豬3型腺病毒。

8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟（4）中，檢測E1缺失PAV3病毒在ST-E1-E1Blarge-ISceI上感染和增殖能力；檢測E1缺失PAV3病毒基因組在ST-E1-E1Blarge-ISceI上的包裝拯救能力；比較ST-E1-E1B-Isce I細胞株與專利保護細胞VR1BL包裝和病毒增殖效率。

9.一種制備缺失E1基因豬3型腺病毒疫苗的方法，其特征在于，是將缺失E1基因豬3型腺病毒接種至權利要求1所述的能夠增殖和包裝缺失E1重組豬3型腺病毒的細胞系上制備得到。

10.一種缺失E1基因豬3型腺病毒疫苗，其特征在于，其是通過權利要求9所述的方法制備得到。