[發明專利]一種含有D-海藻糖的人類精子冷凍保護劑及其制備方法

有效

• 申請號: 201610252243.3
• 申請日: 2016-04-21
• 公開（公告）號: CN105746494B
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 宋春英;郭興萍;史雅萍;王慧芳;寧偉霞;王靜;鄧佳佳;袁亞男;李曉蓉;邢麗俊
• 申請（專利權）人: 山西省人口計生委科學研究所
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司) 14105
• 代理人: 雷立康

本發明涉及一種含有D?海藻糖的人類精子冷凍保護劑及其制備方法。本發明主要是解決現有人類精子慢速冷凍保護劑存在的精子活動力下降和復蘇率偏低的技術問題。本發明的技術方案是：一種含有D?海藻糖的人類精子冷凍保護劑，其每100ml的人類精子冷凍保護劑中含有下列組分的物質：葡萄糖1.5?1.6g、檸檬酸三鈉二水合物1.3g、甘氨酸1.3g、甘油20ml、雞蛋卵黃20ml、D—海藻糖2.0?2.5g和去離子水60ml。其制備方法是：1)在去離子水中加入葡萄糖、檸檬酸三鈉二水合物和D—海藻糖制得混合液；2)再加入甘油和甘氨酸；3)過濾器過濾；4)加入卵黃；5)放入水浴箱中孵育；6)檢測溶液的pH值；7)進行無菌檢測；8)進行精子存活試驗檢測；9)放入的試管中在–70℃下保存。

技術領域

本發明涉及一種含有D-海藻糖的人類精子冷凍保護劑及其制備方法，它屬于一種用于人類精子的超低溫冷凍保存劑及其生產方法。

背景技術

人類精子冷凍技術是生殖醫學中的重要領域，精子的活動能力與男性生育力明顯相關，在人類精子保存工作中，冷凍保護劑配制，直接決定了復蘇后精子的質量。人類精子的冷凍按照精子數量的多少分為快速冷凍和慢速冷凍方法，快速冷凍方法主要用于精子數量極少的標本，采用玻璃化冷凍方法達到快速降溫的目的。而對于冷凍精子數量多，精液量大的標本，只能采用慢速冷凍達到冷凍目的，這也是人類精子庫大量冷凍保存精液的方法。

多年來，科學家一直在探索，不斷提高精子的復蘇率，眾多學者對精子冷凍保護劑做了大量研究。冷凍保護劑按照添加甘油的多少分三類：單一甘油型、甘油復合型、無甘油型。人類精子庫應用較多的是甘油復合型。在精子冷蘇過程中，細胞內冰晶的形成及溶液效應是精子損傷的主要原因，甘油是一種滲透型保護劑，與精液混合后，能很快滲入精子細胞內，降低細胞內液冰點，減少冰晶的形成，達到保護精子膜的作用，已經報道的保護劑成份不一，冷凍效果存在差異。最常采用的冷凍保護液配方為WHO《人類精液檢查與處理實驗手冊(第五版)》推薦的基準配方。該基準配方可以滿足一般需求，但采用該配方冷凍的精子復蘇率較低，導致捐精志愿者合格率很低，維持在10％左右，為了提高捐精合格率，各精子庫在不斷的改進冷凍方法和冷凍保護劑。

發明內容

本發明的目的是解決現有人類精子慢速冷凍保護劑存在的精子活動力下降和復蘇率偏低的技術問題，提供一種含有D-海藻糖的人類精子冷凍保護劑及其制備方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：

一種含有D-海藻糖的人類精子冷凍保護劑，其每100ml的人類精子冷凍保護劑中含有下列組分的物質：

葡萄糖1.5-1.6g、檸檬酸三鈉二水合物1.3g、甘氨酸1.3g、甘油20ml、雞蛋卵黃20ml、D—海藻糖2.0-2.5g和去離子水60ml。

一種制備上述的含有D-海藻糖的人類精子冷凍保護劑的方法，其包括下列步驟：

1)在60ml的無菌去離子水中加入1.5-1.6g的葡萄糖、1.3g的檸檬酸三鈉二水合物和2.0-2.5g的D—海藻糖，制得含D—海藻糖的混合液；

2)在混合液中加入20ml的甘油，混合均勻后再加入1.3g的甘氨酸，攪勻；

3)上述步驟中的物質完全溶解后用0.22μm的細孔過濾器過濾；

4)在過濾后的溶液中加入20ml的新鮮雞蛋卵黃；

5)將加入雞蛋卵黃的溶液放入56℃的水浴箱中孵育40分鐘，并且每隔5分鐘攪拌一次；

6)孵育完成后，檢測溶液中的pH值，如果pH值超出6.8-7.2之間范圍，丟棄重新制備；若在6.8-7.2之間，用1N無菌NaOH溶液調pH值至7.2；

7)對pH值達到7.2的溶液細菌培養進行無菌檢測；