[發明專利]一種快速篩選天然產物中拓撲異構酶I抑制劑的方法

有效

• 申請號: 201610249760.5
• 申請日: 2016-04-21
• 公開（公告）號: CN105717250B
• 公開（公告）日: 2017-04-19
• 發明（設計）人: 郭明全;陳桂林;田永強;張春云
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢植物園
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所42001
• 代理人: 黃瑞棠

發明領域

本發明涉及天然產物分析領域，尤其涉及一種快速篩選天然產物中拓撲異構酶I抑制劑的方法；具體地說，本發明是利用超濾膜技術與色譜、質譜聯用技術從天然產物提取物或其單體化合物中快速篩選拓撲異構酶I抑制劑的方法。

背景技術

DNA拓撲異構酶I，是廣泛存在于原核和真核生物體內的一種必需酶，其催化部位的酪氨酰殘基攻擊DNA單鏈，使得酶與DNA 3'-磷酸二脂鍵形成共價連接，造成DNA單鏈的斷裂，從而通過調節超螺旋、連鎖、去連鎖以及核酸解結作用，影響DNA拓撲結構。靶向藥物是目前應用于癌癥治療的最先進的藥物，它通過與腫瘤發生、生長所必需的特定靶點作用來阻止腫瘤細胞的生長。研究發現，拓撲異構酶在腫瘤細胞中表現出不受其他因素影響的高水平表達，特別是結腸癌、宮頸癌和卵巢癌等的拓撲異構酶I含量及活性遠高于正常體細胞，尤其在S期腫瘤細胞中活性大幅提高。因此，拓撲異構酶I抑制劑可選擇性地抑制增殖期腫瘤細胞DNA復制，阻止腫瘤細胞快速增殖，進而殺死腫瘤細胞。由于拓撲異構酶I抑制劑具有眾多優越性，美國國家癌癥研究所藥物機制分析電腦網絡系統已將拓撲異構酶I抑制劑列為重點研究的六大類抗腫瘤藥物之一，該酶已成為設計新型抗癌藥物的重要新靶點，對其抑制劑的研究可為腫瘤的治療提供新的臨床藥物和技術手段。

拓撲異構酶I抑制劑的常規篩選法一般使用光譜法、表面等離子共振法、X射線散色法、量熱法和核磁共振法等(Chenxi Yao，Na Na，Lingyun Huang，Dacheng He，Jin Ouyang.Analytica Chimica Acta，2013，79，60-66；Vanisree Mulabagal，Angela I.Calderon，Analytical Chemistry，2010，82，3616–3621)，上述方法方便快捷，可在一定程度上滿足篩選需求。然而光譜法因存在背景干擾而易產生假陰性和假陽性結果；核磁共振檢測過程不能提供快速交換反應中蛋白質-配體相互作用的詳細特征等。超濾質譜連用技術結合了超濾裝置優良的分離功能與質譜技術高速、高靈敏性、高準確度等特性，具有分析速度快、特異性強和高通量的特點，可便捷地識別與生物靶分子相結合的藥物配體，同時樣品分析用量少、譜圖信息量大，在藥物小分子配體和生物大分子受體相互作用研究方面具有很大的優勢(Shun Xiao，Runru Yu，Ni Ai，Xiaohui Fan.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2015，104，67–74；Xingxin Yang，Dan Wang，Zhiwei Yang，et al.Journal of Chromatography A，2015，1413，33–46)。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術存在的缺點和不足，提供一種快速篩選天然產物中拓撲異構酶I抑制劑的方法，可用于分析天然產物提取物或者單體化合物對拓撲異構酶I體外富集率。

本發明的目的是這樣實現的：

本發明所述的天然產物提取物或者單體化合物對拓撲異構酶I體外富集率是指天然產物提取物或者單體化合物與拓撲異構酶I進行孵化和結合后，受體-配體復合物經有機溶劑處理使小分子配體釋放出來，用液相-質譜檢測釋放出來的活性化合物，計算各成分與拓撲異構酶I結合的濃度變化及其比值。

具體地說，本方法包括以下步驟：

所述的超濾質譜聯用技術是指一種將超濾膜技術與色譜、質譜分析方法聯合使用所形成的一種新的研究手段；

所述的拓撲異構酶I抑制劑是天然產物提取物或其單體化合物；本發明天然產物鼠李提取物、石蒜生物堿提取物、單體化合物重樓皂苷I、II、VI和VII；

①酶結合反應緩沖液的配制

酶結合反應緩沖液包括：

醋酸鉀：50毫摩爾/升，三羥甲基氨基甲烷-醋酸：20毫摩爾/升，

醋酸鎂：10毫摩爾/升，二硫蘇糖醇：1毫摩爾/升；

精確稱取醋酸鉀4907毫克、三羥甲基氨基甲烷-醋酸2422.8毫克、醋酸鎂2144.6毫克和二硫蘇糖醇154.3毫克，使用去離子水溶解至終體積為1升，充分混合后，25℃下pH值為7.9；

②待測樣品的配制

精確稱取適量待測樣品，用酶結合反應緩沖液充分溶解，待測液終濃度為1.0-3.0毫克/毫升；

所述的待測樣品是鼠李提取物或石蒜生物堿提取物；

③標準溶液的配制