[發(fā)明專利]一種快速篩選天然產(chǎn)物中拓撲異構(gòu)酶I抑制劑的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610249760.5
• 申請日: 2016-04-21
• 公開（公告）號: CN105717250B
• 公開（公告）日: 2017-04-19
• 發(fā)明（設計）人: 郭明全;陳桂林;田永強;張春云
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院武漢植物園
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所42001
• 代理人: 黃瑞棠

1.一種快速篩選天然產(chǎn)物中拓撲異構(gòu)酶I抑制劑的方法，其特征在于包括以下步驟：

超濾質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是指一種將超濾膜技術(shù)與色譜、質(zhì)譜分析方法聯(lián)合使用所形成的一種新的研究手段；

①酶結(jié)合反應緩沖液的配制(1)

酶結(jié)合反應緩沖液包括：

醋酸鉀：50毫摩爾/升，三羥甲基氨基甲烷-醋酸：20毫摩爾/升，

醋酸鎂：10毫摩爾/升，二硫蘇糖醇：1毫摩爾/升；

精確稱取醋酸鉀4907毫克、三羥甲基氨基甲烷-醋酸2422.8毫克、醋酸鎂2144.6毫克和二硫蘇糖醇154.3毫克，使用去離子水溶解至終體積為1升，充分混合后，25℃下pH值為7.9；

②待測樣品的配制(2)

精確稱取適量待測樣品，用酶結(jié)合反應緩沖液充分溶解，待測液終濃度為1.0-3.0毫克/毫升；

所述的待測樣品是鼠李提取物或石蒜生物堿提取物；

③標準溶液的配制(3)

用乙腈將內(nèi)標樣品配制成濃度為100微克/毫升的標準母液，進行質(zhì)譜檢測前加入至待測樣品液中，終濃度為2.0-5.0微克/毫升；

所述的內(nèi)標樣品為異夏佛塔苷或荷葉堿；

④待測樣品與正常和失活拓撲異構(gòu)酶I的結(jié)合反應(4)

實驗組：在0.2毫升的離心管中依次加入100微升的待測樣品液與10微升濃度為0.5U/微升的DNA拓撲異構(gòu)酶I，37℃下孵育30分鐘；將反應混合液轉(zhuǎn)移至截留分子質(zhì)量為3萬道爾頓的超濾管中，在10000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘；加入200微升緩沖液洗去未結(jié)合成分，并再次在10000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘；重復上述步驟2次，合并濾液；向超濾管中加入200微升的90％乙腈，室溫下放置10分鐘后，10000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘，釋放配體；重復上述步驟2次，合并濾液；將上述所得濾液吹干并加入50微升的90％乙腈溶解，用于色譜-質(zhì)譜分析；

對照組：在0.2毫升的離心管中依次加入100微升的待測樣品液與10微升于沸水中放置10分鐘滅活的濃度為0.5U/微升的DNA拓撲異構(gòu)酶I，37℃下孵育30分鐘；將反應混合液轉(zhuǎn)移至截留分子質(zhì)量為3萬道爾頓的超濾管中，在10000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘；加入200微升緩沖液洗去未結(jié)合成分，并再次在10000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘；重復上述步驟2次，合并濾液；向超濾管中加入200微升的90％乙腈，室溫下放置10分鐘后，10000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘，釋放配體；重復上述步驟2次，合并濾液；將上述所得濾液吹干并加入50微升的90％乙腈溶解，用于色譜-質(zhì)譜分析；

⑤反應樣品的色譜-質(zhì)譜檢測分析(5)

以內(nèi)標法定量，對步驟④中兩組樣品溶液進行高效液相和質(zhì)譜檢測；根據(jù)色譜圖中各峰的峰面積與內(nèi)標樣品的峰面積比，計算各成分相對濃度；

對提取物待測樣品、實驗組和對照組樣品進行高效液相色譜和質(zhì)譜檢測；

⑥拓撲異構(gòu)酶I對抑制劑的富集率(6)

拓撲異構(gòu)酶I對拓撲異構(gòu)酶I抑制劑的富集率，可通過酶作用前后待測樣品中各個色譜峰曲線下截面積的變化進行計算評價；

分別根據(jù)未處理待測樣品、與拓撲異構(gòu)酶I作用前后的實驗組、對照組中各個色譜峰曲線下截面積，依據(jù)如下公式計算拓撲異構(gòu)酶I對拓撲異構(gòu)酶I抑制劑的富集率：

EF＝(A_實驗-A_對照)/A_待測×100％

式中，EF為拓撲異構(gòu)酶對I抑制劑的富集率，A_實驗為樣品與拓撲異構(gòu)酶I作用后色譜峰的截面積，A_對照為樣品與滅活拓撲異構(gòu)酶I作用后色譜峰的截面積，A_待測為未與拓撲異構(gòu)酶I發(fā)生作用的待測樣品中色譜峰的截面積。