[發明專利]一種同時表達n個蛋白或蛋白亞基的方法及其專用系統

有效

• 申請號: 201610248592.8
• 申請日: 2016-04-20
• 公開（公告）號: CN107304432B
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 翟宇佳;孫飛
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/866;C07K19/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;何葉喧

本發明公開了一種同時表達n個目的物的方法及其專用系統。同時表達n個目的物的系統，包含DNA甲和DNA乙；n為2以上的自然數；目的物為蛋白或蛋白亞基或蛋白片段或多肽或多肽片段；所述DNA甲依次包括如下元件：啟動子甲、融合基因甲、終止序列甲；所述DNA乙依次包括如下元件：啟動子乙、融合基因乙、終止序列乙。實驗證明，將編碼人源COPI復合體的各個亞基的編碼基因插入重組質粒pFBD?mCEG?COPI，轉化受體菌獲得重組桿狀病毒穿梭載體，進一步轉染昆蟲細胞，可獲得有活性的人源COPI復合體。因此，本發明所提供的同時表達n個目的物的系統在同時表達多個蛋白或蛋白亞基或多肽或多肽片段中具有重要的應用價值。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種同時表達n個蛋白或蛋白亞基的方法及其專用系統。

背景技術

桿狀病毒表達系統(Baculovirus Expression System，BVES)是在昆蟲細胞中高效表達外源蛋白質的用力工具，具有安全性好、表達水平高、可進行翻譯后加工等優點。由于桿狀病毒的基因組龐大，外源基因的克隆不能通過酶切連接的方法直接插入，所以人們對桿狀病毒基因組進行改造，并構建與之相匹配的轉移載體，使兩者重組為能夠感染昆蟲細胞的含外源基因的重組桿狀病毒。在目前廣泛使用的Bac to Bac系統中，桿狀病毒穿梭載體(Bacmid)既可以在大腸桿菌中復制，又可以感染鱗翅目昆蟲細胞，其在大腸桿菌中可以與含外源基因的匹配轉移載體發生Tn7位點特異性重組。重組得到的桿狀病毒穿梭載體能在大腸桿菌中高效復制，被提純后可用于轉染昆蟲細胞。

桿狀病毒基因組容量大，可以在轉移載體上插入多個開放閱讀框(ORF，OpenReading Frame)，繼而使得到的重組桿狀病毒穿梭載體在昆蟲細胞中同時表達多個蛋白質。這也是目前在昆蟲細胞中實現多種蛋白質共表達的通用思路。

質粒pFastBac-Dual含有兩個頭對頭放置的開放閱讀框(ORF，Open ReadingFrame)，一個ORF以p10啟動子起始，HSV tk polyadenylation信號序列終止；另一個ORF以polyhedrin啟動子起始，SV40polyadenylation信號序列終止。質粒pFastBac-Dual可以作為轉移載體，但只能同時表達兩種蛋白質，若要表達兩種以上的蛋白質，則需要另構建其它轉移載體。例如要表達由四種不同亞基構成的蛋白質復合物，需要經過如下步驟：(1)構建重組質粒pFastBac-Dual-A-B(含A基因和B基因的質粒pFastBac-Dual)和重組質粒pFastBac-Dual-C-D(含C基因和D基因的質粒pFastBac-Dual)；(2)將步驟(1)構建的重組質粒分別與Bacmid進行重組，得到兩種重組Bacmid；(3)將步驟(2)得到的兩種重組Bacmid分別轉染昆蟲細胞，得到兩種病毒。(4)用步驟(3)得到的兩種病毒同時感染昆蟲細胞，實現四種亞基的共表達。這種多病毒共感染方法的蛋白表達量通常要低于單一病毒感染細胞的蛋白表達量。

近幾年流行的MultiBac系統考慮到這一點，只用一種重組Bacmid感染細胞，進行蛋白質復合體的表達。該系統的表達思路也是一個ORF表達一種蛋白質。通過受體質粒與供體質粒上LoxP位點介導的重組，實現質粒的融合，將不同來源的ORF整合到一個轉移載體上，然后與Bacmid重組，實現多種蛋白質的共表達。這種方法的局限性為要構建多種含目的基因的供體質粒與受體質粒，供體質粒與受體質粒要經過多次整合與篩選，才能得到最終用于表達的轉移載體，耗時耗力。

上述兩種方法除了分子克隆操作繁瑣外，還含有以下幾種缺陷：一是在表達過程中無法控制各個亞基的拷貝數，最終無法純化到性質較為均一的蛋白質復合體；二是在病毒感染過程中無法判斷目的蛋白是否表達。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是如何同時表達n個蛋白或蛋白亞基。

為解決上述技術問題，本發明首先提供了一種同時表達n個目的物的系統，所述目的物為蛋白或蛋白亞基或蛋白片段或多肽或多肽片段。