[發明專利]一種固定化菌體生物法轉化單寧酸重復制備沒食子酸的方法

在審

• 申請號: 201610248509.7
• 申請日: 2016-04-21
• 公開（公告）號: CN105695518A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 邱樹毅;吳鑫穎;王廣莉;簡輝;周鴻翔;王曉丹;任佳明;周羅娜
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: C12P7/42
• 分類號: C12P7/42;C12N11/02;C12R1/685
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 吳無懼

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種固定化菌體生物法轉化 單寧酸重復制備沒食子酸的技術。

背景技術

沒食子酸(gallicacid，GA)又稱倍酸、五倍子酸，為白色或 淡黃色針狀結晶粉末，化學名稱3,4,5-三羥基苯甲酸，分子式為 C6H2(OH)3COOH，分子量170.12。

沒食子酸是一種重要的精細化工原料，能廣泛應用于化工、農業、 食品、制藥等行業?？珊铣扇玖?、金屬提取劑，可制備性能優良的食 品抗氧化劑沒食子酸酯；能作為醫藥中間體，合成重要的醫藥產品； 沒食子酸可以用來制造多種燃料、焰火穩定劑、阻燃劑、著色劑和笛 音劑，可以作為植物生長調節劑，與維生素C配合強化餌料養魚， 也是紫外線吸收劑、半導體光致抗蝕原料，可配制防銹底漆和鋁合金 有機涂層，配制水基鉆探泥漿用流化劑。用于制革，照相顯影劑，檢 測游離無機酸、二羥基丙酮、生物堿和金屬等的分析試劑。

沒食子酸制備是采用富含單寧的物質通過對單寧酸分子中酯鍵的水 解而獲得。目前，沒食子酸的制備方法可分為化學法與生物法，化學 法根據所使用的催化劑的不同，可分為酸水解法與堿水解法，生物法 又可分為發酵法和酶法?；瘜W法存在副反應多，水解液的色澤較深， 沒食子酸產品純度普遍不高，生產過程中產生具有酸高、鈉離子含量 高、酚類物質多，色度深、不太適合微生物處理的大量廢水及脫色活 性炭的廢渣，對環境污染嚴重，處理成本高等不足。酶法是利用單寧 酶高效、專一、定向水解單寧酸制備沒食子酸，但存在需從菌體中分 離純化單寧酶，其酶的生產成本較高，酶作用的反應時間長等不足。 發酵法是利用高產單寧酶的生產菌株直接降解沒食子單寧制備沒食 子酸，不用分離純化單寧酶，但存在培菌時間較長，使整個轉化生產 周期長，成本高等特點。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：對高產單寧酶的生產菌體進行固定 化，利用生物法轉化重復單寧酸制備沒食子酸的技術，達到減少酶的 分離、純化，實現菌體的多次重復利用，降低了生產成本和污染，簡 化了工藝，縮短了生物法轉化制備沒食子酸的周期，產物產率也有較 大提高的目的。從而為實現單寧酸生物法轉化制備沒食子酸的高效、 清潔、低成本的規模化生產提供可能。

本發明的技術方案是：一種固定化菌體生物法轉化單寧酸重復制 備沒食子酸的方法，包含以下步驟：(1)單寧酶孢子懸浮液的制備： 黑曲霉B1401的活化及其生產菌孢子懸浮液的制備；(2)固定化細胞 的制備：產酶培養基配置、載體材料的處理和固定化細胞的制備及其 產酶培養；(3)固定化菌體生物法轉化單寧酸制備沒食子酸：在經培 菌產酶好的固定化菌體溶液中添加單寧酸進行反應，得到沒食子酸； (4)固定化菌體生物法重復轉化單寧酸制備沒食子酸：將步驟(3) 中轉化好的發酵液進行固定化菌體與發酵液分離，重新在固定化菌體 中分批添加與上述相同量的單寧酸溶液，重復步驟(3)對單寧酸溶 液進行反復轉化，再分離之后再轉化。

所述的菌種的活化：將黑曲霉B1401轉接到察氏斜面培養基后， 放入霉菌培養箱中，于30℃條件下培養70～80h。

所述的生產菌孢子懸浮液的制備：將經活化的試管斜面加入生理 鹽水，充分震蕩、稀釋后制得孢子懸浮液。

所述的產酶培養基：6％單寧酸，2.5％葡萄糖，1％(NH₄)₂SO₄，0.1％ MgSO₄·7H₂O，0.1％NaNO₃，0.1％K₂HPO₄·3H₂O，pH值5.0，其中百分比 均為w/v。

所述的載體材料的處理：將絲瓜瓤狀的聚酯纖維材料剪成立方塊， 經鹽酸浸泡洗滌,后經氫氧化鈉洗滌，最后用蒸餾水徹底洗至中性后， 烘干備用。

所述的固定化細胞的制備：取處理后的載體材料，投入經滅菌后 產酶培養基中，按體積比2％～2.5％的比例接入生產菌的孢子懸浮液， 在轉速160～180r/min，溫度35℃的條件下進行產酶培養72～84h。

所述的步驟(3)中的反應條件為：將經發酵產酶好的固定化菌株 溶液，分批添加總量為18％～20％的單寧酸，反應轉速140～160r/min， 反應溫度35℃，pH維持在4.0～5.0的條件下，反應44～48h。