[發(fā)明專利]利用基因?qū)χ参镞M(jìn)行種屬鑒定的方法

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• 申請日: 2016-04-20
• 公開（公告）號: CN105734153A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫子奎;王鋒;丁方美;李嫦娥;方婉
• 申請（專利權(quán)）人: 上海派森諾生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31227
• 代理人: 吳澤群

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種利用基因?qū)χ参镞M(jìn)行種屬鑒定的方法。

背景技術(shù)

DNA條形碼技術(shù)是利用標(biāo)準(zhǔn)的、具有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對較短的DNA片段在物種內(nèi)的特異性和種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識別系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)對物種的快速自動鑒定。將核酸序列數(shù)據(jù)用于探討植物系統(tǒng)發(fā)育問題現(xiàn)已發(fā)展成為植物系統(tǒng)學(xué)中的一個重要分支領(lǐng)域。

自2005年開展植物DNA條形碼研究以來，國內(nèi)外學(xué)者圍繞植物DNA條形碼的篩選,在不同類群中對各個DNA候選片段進(jìn)行適用性評價,最終正式提議rbcL+matK作為陸生植物標(biāo)準(zhǔn)。

rbcL是編碼1,5二磷酸核酮糖羧化酶大亞基的基因，此酶在Calvin-Benson循環(huán)中固定二氧化碳，且在C3植物的光呼吸過程中起作用，其進(jìn)化速度趨于保守，能將未知植物鑒定到科、屬水平。

matK基因位于葉綠體賴氨酸t(yī)RNA基因高度保守的2個外顯子之間的內(nèi)含子中，為單拷貝編碼基因，編碼參與RNA轉(zhuǎn)錄本II型內(nèi)含子剪切的成熟酶。是葉綠體基因組編碼蛋白基因中，進(jìn)化較快的基因之一，進(jìn)化速率快于rbcL，能將未知植物鑒定到屬、種水平。

葉綠體基因組中的rbcL基因序列是分子系統(tǒng)學(xué)研究中使用最為廣泛的分子指標(biāo)之一。它在用于此目的的研究時具有一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：以單拷貝形式存在，不發(fā)生基因轉(zhuǎn)變；長達(dá)1.4kb；能提供較多的分子性狀；進(jìn)化速率比較適于研究高等級類元間的系統(tǒng)關(guān)系。

植物種屬鑒定的基本原理是基于植物cpDNA中的保守序列rbcL和matK的PCR擴(kuò)增和測序，將測序結(jié)果與公共數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比較后，判定動物種類，講未知物種劃分到屬或種。并且，在PCR擴(kuò)增中，引物設(shè)計(jì)的合理與否將直接影響到鑒定時間長短、準(zhǔn)確度等。

現(xiàn)有技術(shù)大多使用形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定，如八角屬約有60種，其中只有一種叫八角茴香沒有毒，它的成熟果實(shí)為調(diào)味香料。另外的種尤其是莽草這個種，果實(shí)則有劇毒。如果用形態(tài)學(xué)的方法鑒定，極其容易弄混，導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種利用基因?qū)χ参镞M(jìn)行種屬鑒定的方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明涉及一種利用基因?qū)χ参镞M(jìn)行種屬鑒定的方法，所述方法包括如下步驟：

S1、待測植物樣品基因組DNA提取；

S2、以待測植物樣品基因組DNA為模板，用針對rbcL基因序列設(shè)計(jì)的引物和/或針對matK基因序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

S3、回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得目的DNA；

S4、利用基于Sanger雙脫氧鏈終止法對所述目的DNA進(jìn)行測序；將測序結(jié)果與公共數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，根據(jù)同源性將待測植物鑒定到屬或種。

優(yōu)選的，步驟S2中，所述針對rbcL基因序列設(shè)計(jì)的引物包括如SEQIDNO.1所示的正向引物和如SEQIDNO.2所示的反向引物。

優(yōu)選的，步驟S2中，所述針對matK基因序列設(shè)計(jì)的引物包括如SEQIDNO.3所示的正向引物和如SEQIDNO.4所示的反向引物。

優(yōu)選的，步驟S2中，所述PCR擴(kuò)增中，每50.0ul擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：基因組DNA1.0ul，含2.5mMMg2+的10×Buffer5.0ul，5u/μL的Taq聚合酶1.0ul，10mM的dNTP1.0ul，10uM的正向引物1.5ul，10uM的反向引物1.5ul，ddH2O39.0ul。

優(yōu)選的，步驟S2中，所述PCR擴(kuò)增中，PCR反應(yīng)參數(shù)為：預(yù)變性95℃，5min；變性95℃，30s；退火55℃，45s；延伸72℃，1min30s；終延伸72℃，7m；循環(huán)數(shù)45。

優(yōu)選的，步驟S3中，所述回收是用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1)從分子水平鑒定植物的種屬，比從形態(tài)學(xué)鑒定更加準(zhǔn)確；

2)對植物形態(tài)的完整性沒有太多的要求，只要有植物本身少許的組織即可提取DNA，并進(jìn)行本發(fā)明的鑒定；

3)本發(fā)明通過對引物設(shè)計(jì)的合理設(shè)計(jì)，縮短了鑒定時間，顯著提高了鑒定的準(zhǔn)確度。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。