[發(fā)明專利]快速提取線粒體DNA的方法及其應(yīng)用與相關(guān)試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610246606.2
• 申請(qǐng)日: 2016-04-20
• 公開（公告）號(hào): CN105779440A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 艾南平;魏彥剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京伯一科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京三友知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11127
• 代理人: 韓蕾;姚亮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及快速提取DNA的方法及其應(yīng)用，特別涉及快速提取線粒體DNA的方法及 其應(yīng)用與相關(guān)試劑盒。

背景技術(shù)

線粒體DNA是人體細(xì)胞內(nèi)唯一的核外遺傳物質(zhì)，線粒體的染色體長(zhǎng)約16000個(gè)核苷 酸，染色體是環(huán)狀的，而且突變率高于核中DNA，有些遺傳病如Leber遺傳性視神經(jīng)病、肌陣 攣性癲癇、糖尿病-耳聾綜合征等與線粒體基因突變有關(guān)。

Leber遺傳性視神經(jīng)病為視神經(jīng)退行性變的母系遺傳性疾病。男性患者居多，常于 15～35歲發(fā)病，臨床主要表現(xiàn)為雙眼同時(shí)或先后急性或亞急性無痛性視力減退，同時(shí)可伴 有中心視野缺失及色覺障礙。視力損害嚴(yán)重程度差異較大，可由完全正常、輕度、中度到重 度。線粒體中9種編碼蛋白的基因(ND1，ND2，CO1，ATP6，CO3，ND4，ND5，ND6，CYTB)中，至少有 18種錯(cuò)義突變可直接或間接地導(dǎo)致Leber表型的出現(xiàn)。90％以上的病例中存在三種突變 (MTND1*LHON3460A，MTND4*LHON11778A，MTND6*LHON14484C)。

現(xiàn)有對(duì)Leber疾病在基因水平的檢測(cè)方法較多，大致都包含血液基因組DNA抽提、 DNA目的片段的體外分別擴(kuò)增(以上三個(gè)位點(diǎn)需要進(jìn)行3次獨(dú)立PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn))、擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè) 序檢查三個(gè)步驟。

外周血因其屬無創(chuàng)傷獲取且獲取簡(jiǎn)單，是最容易被患者接受的檢查樣品，因此也 是臨床檢測(cè)用到最多的樣品之一。但現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)和方法，在檢查外周血線粒體DNA基因序 列時(shí)，需要先將血液細(xì)胞中基因全部抽提出來，才能作為模板進(jìn)行下游的PCR擴(kuò)增。雖然這 樣做并不直接影響最后檢測(cè)的結(jié)果，但由于血液DNA抽提步驟多，過程繁瑣，外加臨床樣品 的數(shù)量極大，現(xiàn)有的方法不但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且很容易在操作過程增加樣品的二次污染。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)中提取線粒體DNA抽提步驟多、過程繁瑣的技術(shù)問題，本發(fā)明的目 的之一在于提供一種提取線粒體DNA的方法，所述方法能夠簡(jiǎn)便快速的提取血液或組織中 線粒體DNA。

本發(fā)明再一目的在于提供提取線粒體DNA的試劑盒。

本發(fā)明另一目的在于提供提取線粒體DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法。

本發(fā)明再一目的在于提供提取線粒體DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試劑盒。

本發(fā)明的另一目的在于提供用于檢測(cè)Leber遺傳性視神經(jīng)病的試劑盒。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供提取線粒體DNA的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)將組織樣品或去除紅細(xì)胞后的血液樣品進(jìn)行分散；

(2)在分散后的細(xì)胞樣品中加入裂解緩沖液，所述裂解緩沖液為包含Tris-HCl及 TritonX-100的水溶液，該Tris-HCl的摩爾濃度為19～21mM，其pH為8.7～8.9；該TritonX- 100的體積濃度為0.09～0.11％；或

所述裂解緩沖液為包含Tris-HCl及SDS的水溶液，該Tris-HCl的摩爾濃度為19～ 21mM，其pH為8.7～8.9；該SDS的質(zhì)量濃度為0.09％～0.11％；

(3)分離步驟(2)上清液，提取得到所述樣品的線粒體DNA。

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，依據(jù)線粒體DNA獨(dú)立于基因組DNA之外且以環(huán)狀形式 存在于細(xì)胞中的特征，利用由上述組分構(gòu)成的裂解液對(duì)細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的蛋白進(jìn)行簡(jiǎn)單裂 解、變性處理，將線粒體DNA釋放出來，完成了整個(gè)線粒體DNA的提取，減去了整個(gè)基因組DNA 抽提過程，從而短時(shí)間內(nèi)獲得了可作為擴(kuò)增模板的線粒體DNA。由本發(fā)明方法提取的線粒體 DNA與現(xiàn)有的技術(shù)抽提出DNA濃度擴(kuò)增效果一致。采用本發(fā)明的方法不但大大減輕了操作人 員的工作強(qiáng)度，而且可以最大限度的避免因操作所導(dǎo)致的樣品的相互污染。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，在本發(fā)明所述提取線粒體DNA的方法中，步驟(2)中 所述裂解緩沖液為包含Tris-HCl及TritonX-100的水溶液，該Tris-HCl的摩爾濃度為20mM， 其pH為8.8；該TritonX-100的體積濃度為0.1％；或

所述裂解緩沖液為包含Tris-HCl及SDS的水溶液，該Tris-HCl的摩爾濃度為20mM， 其pH為8.8；該SDS的質(zhì)量濃度為0.1％。