[發明專利]快速提取線粒體DNA的方法及其應用與相關試劑盒

在審

• 申請號: 201610246606.2
• 申請日: 2016-04-20
• 公開（公告）號: CN105779440A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 艾南平;魏彥剛
• 申請（專利權）人: 北京伯一科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 韓蕾;姚亮

1.提取線粒體DNA的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)將組織樣品或去除紅細胞后的血液樣品進行分散；

(2)在分散后的細胞樣品中加入裂解緩沖液，所述裂解緩沖液為包含Tris-HCl及 TritonX-100的水溶液，該Tris-HCl的摩爾濃度為19～21mM，其pH為8.7～8.9；該TritonX- 100的體積濃度為0.09～0.11％；或

所述裂解緩沖液為包含Tris-HCl及SDS的水溶液，該Tris-HCl的摩爾濃度為19～21mM， 其pH為8.7～8.9；該SDS的質量濃度為0.09％～0.11％；

(3)分離步驟(2)上清液，提取得到所述樣品的線粒體DNA。

2.根據權利要求1所述的提取線粒體DNA的方法，其中，步驟(2)中所述裂解緩沖液為包 含Tris-HCl及TritonX-100的水溶液，該Tris-HCl的摩爾濃度為20mM，其pH為8.8；該 TritonX-100的體積濃度為0.1％；或

所述裂解緩沖液為包含Tris-HCl及SDS的水溶液，該Tris-HCl的摩爾濃度為20mM，其pH 為8.8；該SDS的質量濃度為0.1％。

3.根據權利要求1或2所述的提取線粒體DNA的方法，其中，步驟(2)中分散后的細胞樣 品的體積與所述裂解緩沖液的體積比為8～10:1，優選9:1。

4.根據權利要求3所述的提取線粒體DNA的方法，其中，所述加熱是在95～100℃加熱9 ～11min；優選在100℃加熱10min。

5.提取線粒體DNA的試劑盒，其中，所述試劑盒包括裂解緩沖液(10×)，所述裂解緩沖 液(10×)為包含Tris-HCl及TritonX-100的水溶液，該Tris-HCl的摩爾濃度為190～210mM， 其pH為8.7～8.9；該TritonX-100的體積濃度為0.9～1.1％；或

所述裂解緩沖液(10×)為包含Tris-HCl及SDS的水溶液，該Tris-HCl的摩爾濃度為190 ～210mM，其pH為8.7～8.9；該SDS的質量濃度為0.9％～1.1％；

優選地，該試劑盒還包括紅細胞裂解液。

6.提取線粒體DNA并進行PCR擴增的方法，所述方法包括如下步驟：

(a)利用權利要求1～4中任一項所述的提取線粒體DNA的方法提取得到線粒體DNA；

(b)以步驟(a)得到的線粒體DNA為模板，利用引物對1、引物對2及引物對3進行PCR擴 增；選擇性地，將所述線粒體DNA稀釋5～10倍；

其中，所述引物對1包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示序列：

SEQIDNO:1：GCCTACGACAAACAGACCTAAA；

SEQIDNO:2：GGTTGAGGGATA；

所述引物對2包括SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示序列：

SEQIDNO:3：CAATAGGATCCTCCCGAATCAA；

SEQIDNO:4：GTGTGGTCGGGTGTGTTATTA；

所述引物對3包括SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示序列：

SEQIDNO:5：CCTACTCCTCATTGTACCCATTC；

SEQIDNO:6：TGATGTAGAGGGTGATGGTAGA。

7.根據權利要求6所述的提取線粒體DNA并進行PCR擴增的方法，其中，所述PCR擴增采 用20μlPCR體系，所述PCR體系包括：

1.9～2.1μl所述裂解緩沖液、0.3～0.5μldNTP混合物、0.1～0.3μlDNA聚合酶、0.4～ 0.6μl所述引物對1、0.4～0.6μl所述引物對2、0.4～0.6μl所述引物對3、0.9～1.1μl所述模 板及余量的DEPC水；

優選地，所述PCR體系為2.0μl所述裂解緩沖液、0.4μldNTP混合物、0.2μlDNA聚合酶、 0.5μl所述引物對1、0.5μl所述引物對2、0.5μl所述引物對3、1μl所述模板及余量的DEPC水。