[發(fā)明專利]一種非標(biāo)記型核酸適配體傳感器及對(duì)雙酚A的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610246334.6
• 申請(qǐng)日: 2016-04-20
• 公開（公告）號(hào): CN105784810B
• 公開（公告）日: 2018-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊紹明;鄭玥;李玲玲;張小榮;丁紹卿;陳愛(ài)喜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東交通大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N27/327
• 分類號(hào): G01N27/327
• 代理公司: 南昌市平凡知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所36122
• 代理人: 姚伯川

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種非標(biāo)記型核酸適配體傳感器及對(duì)雙酚A的檢測(cè)方法，本發(fā)明屬于化學(xué)傳感和電分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

雙酚A是環(huán)境雌激素類化合物之一，能夠進(jìn)入生物體內(nèi)模仿、阻礙、干擾或者改變生物體自身激素作用，導(dǎo)致身體內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，阻礙神經(jīng)系統(tǒng)傳輸，降低機(jī)體免疫功能，甚至導(dǎo)致器官畸形和癌變，嚴(yán)重威脅人體的健康和生存。因此，對(duì)雙酚A快速準(zhǔn)確的檢測(cè)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

核酸適配體是在體外通過(guò)指數(shù)級(jí)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選出的一段由20~60個(gè)堿基所組成的單鏈或雙鏈寡聚核苷酸，具有高親和力，易于修飾和功能化，能與配體高效、專一結(jié)合等特點(diǎn)。基于核酸適配體的電化學(xué)核酸適配體傳感器，根據(jù)是否采用標(biāo)記物產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)，可分為標(biāo)記型和非標(biāo)記型；標(biāo)記型核酸適配體傳感器的標(biāo)記過(guò)程復(fù)雜、花費(fèi)高，而且在一定程度上會(huì)影響適配體和目標(biāo)分子的結(jié)合親和力。因此，構(gòu)建簡(jiǎn)單、價(jià)廉和靈敏的非標(biāo)記型電化學(xué)核酸適配體傳感器具有重要的意義。

多孔金屬納米材料比普通金屬納米材料有更大的比表面積，可以更好的提高分子固定效率。多孔納米金是其中的典型代表，其具有大的比表面積、良好的生物相容性和導(dǎo)電性，將其用于傳感器的制備可有效增強(qiáng)傳感器的性能。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是，根據(jù)標(biāo)記型核酸適配體傳感器在使用中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種以多孔納米金為固定化核酸適配體的基材，以嵌入雙鏈DNA中的亞甲基藍(lán)為電化學(xué)探針制備的一種非標(biāo)記型核酸適配體傳感器及對(duì)雙酚A的檢測(cè)方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是，本發(fā)明以電沉積法制備的多孔納米金為固定化核酸適配體的基材，利用多孔納米金的大比表面積和良好的生物相容性，將大量的核酸適配體穩(wěn)定地負(fù)載在電極表面。利用核酸適配體對(duì)雙酚A的特異性結(jié)合作用導(dǎo)致雙鏈DNA解鏈，從而使雙鏈DNA中的亞甲基藍(lán)電化學(xué)探針的信號(hào)降低，將核酸適配體修飾電極作為工作電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉑電極，組成三電極體系，實(shí)現(xiàn)對(duì)雙酚A的高靈敏檢測(cè)。

本發(fā)明包括非標(biāo)記型核酸適配體傳感器的制備方法和采用所述測(cè)定雙酚A的核酸適配體傳感器對(duì)雙酚A的檢測(cè)方法。

本發(fā)明一種非標(biāo)記型核酸適配體傳感器的制備方法步驟如下：

（1）將干凈的玻碳電極置于含有0.04~0.12 mol/L的HAuCl₄和0.002~0.006mol/L的Pb(CH₃COO)₂溶液中，于-0.2~ -0.7 V恒電位電沉積20~120 s，制得多孔納米金修飾的玻碳電極。

（2）將多孔納米金修飾電極依次置于含有0.3~1.5 μmol/L的雙酚A核酸適配體中6～24 h，0.5 ~1.5 mmol/L的6-巰基己醇中20～80 min，0.3~1.5 μmol/L的互補(bǔ)DNA中20～80 min，制得雙鏈DNA/多孔納米金修飾的玻碳電極。

（3）將雙鏈DNA/多孔納米金修飾的玻碳電極置于0.1～0.4 mmol/L的亞甲基藍(lán)溶液中浸泡5～25min，利用亞甲基藍(lán)與雙鏈DNA之間的靜電作用，將其嵌入雙鏈DNA中，得到亞甲基藍(lán)/雙鏈DNA/多孔納米金修飾的玻碳電極，該修飾電極即為測(cè)定雙酚A的核酸適配體傳感器。

本發(fā)明基于非標(biāo)記型核酸適配體傳感器對(duì)雙酚A的檢測(cè)方法如下：

本發(fā)明利用核酸適配體傳感器中的雙酚A核酸適配體與雙酚A進(jìn)行特異性結(jié)合后，導(dǎo)致雙鏈DNA解鏈而使嵌入雙鏈DNA中的亞甲基藍(lán)濃度降低，即電化學(xué)探針亞甲基藍(lán)的電流信號(hào)降低，實(shí)現(xiàn)對(duì)雙酚A的檢測(cè)，將前述的核酸適配體傳感器為工作電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉑電極，組成三電極體系，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)雙酚A的檢測(cè)。

本發(fā)明核酸適配體傳感器測(cè)定雙酚A的線性范圍為100.0 fg/mL ~ 100.0 ng/mL，檢測(cè)限為32.9 fg/mL。利用同一根玻碳電極制備四次核酸適配體傳感器，測(cè)定其對(duì)雙酚A的響應(yīng)電流，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%，利用4根玻碳電極平行制備的核酸適配體傳感器對(duì)雙酚A測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%，說(shuō)明該電極具有良好的重現(xiàn)性。該傳感器置于4 ℃的環(huán)境中考察其穩(wěn)定性，一周后，仍保留響應(yīng)電流值的90%以上，表明該電極具有良好的穩(wěn)定性。

本發(fā)明的工作原理是，本發(fā)明在多孔納米金修飾的電極表面，通過(guò)金硫鍵將適配體固定，再將互補(bǔ)DNA鏈與適配體結(jié)合形成雙鏈DNA，最后將作為電化學(xué)探針的亞甲基藍(lán)嵌入雙鏈DNA中，建立一種底物誘導(dǎo)置換互補(bǔ)DNA鏈的非標(biāo)記型核酸適配體傳感器檢測(cè)雙酚A的方法。