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[發(fā)明專(zhuān)利]一種非標(biāo)記型核酸適配體傳感器及對(duì)雙酚A的檢測(cè)方法有效

專(zhuān)利信息
申請(qǐng)?zhí)枺?/td> 201610246334.6 申請(qǐng)日: 2016-04-20
公開(kāi)(公告)號(hào): CN105784810B 公開(kāi)(公告)日: 2018-04-03
發(fā)明(設(shè)計(jì))人: 楊紹明;鄭玥;李玲玲;張小榮;丁紹卿;陳愛(ài)喜 申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人: 華東交通大學(xué)
主分類(lèi)號(hào): G01N27/327 分類(lèi)號(hào): G01N27/327
代理公司: 南昌市平凡知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所36122 代理人: 姚伯川
地址: 330013 江*** 國(guó)省代碼: 江西;36
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摘要:
搜索關(guān)鍵詞: 一種 標(biāo)記 核酸 適配體 傳感器 檢測(cè) 方法
【說(shuō)明書(shū)】:

技術(shù)領(lǐng)域

發(fā)明涉及一種非標(biāo)記型核酸適配體傳感器及對(duì)雙酚A的檢測(cè)方法,本發(fā)明屬于化學(xué)傳感和電分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

雙酚A是環(huán)境雌激素類(lèi)化合物之一,能夠進(jìn)入生物體內(nèi)模仿、阻礙、干擾或者改變生物體自身激素作用,導(dǎo)致身體內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂,阻礙神經(jīng)系統(tǒng)傳輸,降低機(jī)體免疫功能,甚至導(dǎo)致器官畸形和癌變,嚴(yán)重威脅人體的健康和生存。因此,對(duì)雙酚A快速準(zhǔn)確的檢測(cè)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

核酸適配體是在體外通過(guò)指數(shù)級(jí)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選出的一段由20~60個(gè)堿基所組成的單鏈或雙鏈寡聚核苷酸,具有高親和力,易于修飾和功能化,能與配體高效、專(zhuān)一結(jié)合等特點(diǎn)。基于核酸適配體的電化學(xué)核酸適配體傳感器,根據(jù)是否采用標(biāo)記物產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào),可分為標(biāo)記型和非標(biāo)記型;標(biāo)記型核酸適配體傳感器的標(biāo)記過(guò)程復(fù)雜、花費(fèi)高,而且在一定程度上會(huì)影響適配體和目標(biāo)分子的結(jié)合親和力。因此,構(gòu)建簡(jiǎn)單、價(jià)廉和靈敏的非標(biāo)記型電化學(xué)核酸適配體傳感器具有重要的意義。

多孔金屬納米材料比普通金屬納米材料有更大的比表面積,可以更好的提高分子固定效率。多孔納米金是其中的典型代表,其具有大的比表面積、良好的生物相容性和導(dǎo)電性,將其用于傳感器的制備可有效增強(qiáng)傳感器的性能。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是,根據(jù)標(biāo)記型核酸適配體傳感器在使用中存在的問(wèn)題,本發(fā)明提供一種以多孔納米金為固定化核酸適配體的基材,以嵌入雙鏈DNA中的亞甲基藍(lán)為電化學(xué)探針制備的一種非標(biāo)記型核酸適配體傳感器及對(duì)雙酚A的檢測(cè)方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是,本發(fā)明以電沉積法制備的多孔納米金為固定化核酸適配體的基材,利用多孔納米金的大比表面積和良好的生物相容性,將大量的核酸適配體穩(wěn)定地負(fù)載在電極表面。利用核酸適配體對(duì)雙酚A的特異性結(jié)合作用導(dǎo)致雙鏈DNA解鏈,從而使雙鏈DNA中的亞甲基藍(lán)電化學(xué)探針的信號(hào)降低,將核酸適配體修飾電極作為工作電極,參比電極為Ag/AgCl電極,輔助電極為鉑電極,組成三電極體系,實(shí)現(xiàn)對(duì)雙酚A的高靈敏檢測(cè)。

本發(fā)明包括非標(biāo)記型核酸適配體傳感器的制備方法和采用所述測(cè)定雙酚A的核酸適配體傳感器對(duì)雙酚A的檢測(cè)方法。

本發(fā)明一種非標(biāo)記型核酸適配體傳感器的制備方法步驟如下:

(1)將干凈的玻碳電極置于含有0.04~0.12 mol/L的HAuCl4和0.002~0.006mol/L的Pb(CH3COO)2溶液中,于-0.2~ -0.7 V恒電位電沉積20~120 s,制得多孔納米金修飾的玻碳電極。

(2)將多孔納米金修飾電極依次置于含有0.3~1.5 μmol/L的雙酚A核酸適配體中6~24 h,0.5 ~1.5 mmol/L的6-巰基己醇中20~80 min,0.3~1.5 μmol/L的互補(bǔ)DNA中20~80 min,制得雙鏈DNA/多孔納米金修飾的玻碳電極。

(3)將雙鏈DNA/多孔納米金修飾的玻碳電極置于0.1~0.4 mmol/L的亞甲基藍(lán)溶液中浸泡5~25min,利用亞甲基藍(lán)與雙鏈DNA之間的靜電作用,將其嵌入雙鏈DNA中,得到亞甲基藍(lán)/雙鏈DNA/多孔納米金修飾的玻碳電極,該修飾電極即為測(cè)定雙酚A的核酸適配體傳感器。

本發(fā)明基于非標(biāo)記型核酸適配體傳感器對(duì)雙酚A的檢測(cè)方法如下:

本發(fā)明利用核酸適配體傳感器中的雙酚A核酸適配體與雙酚A進(jìn)行特異性結(jié)合后,導(dǎo)致雙鏈DNA解鏈而使嵌入雙鏈DNA中的亞甲基藍(lán)濃度降低,即電化學(xué)探針亞甲基藍(lán)的電流信號(hào)降低,實(shí)現(xiàn)對(duì)雙酚A的檢測(cè),將前述的核酸適配體傳感器為工作電極,參比電極為Ag/AgCl電極,輔助電極為鉑電極,組成三電極體系,即可實(shí)現(xiàn)對(duì)雙酚A的檢測(cè)。

本發(fā)明核酸適配體傳感器測(cè)定雙酚A的線性范圍為100.0 fg/mL ~ 100.0 ng/mL,檢測(cè)限為32.9 fg/mL。利用同一根玻碳電極制備四次核酸適配體傳感器,測(cè)定其對(duì)雙酚A的響應(yīng)電流,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%,利用4根玻碳電極平行制備的核酸適配體傳感器對(duì)雙酚A測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%,說(shuō)明該電極具有良好的重現(xiàn)性。該傳感器置于4 ℃的環(huán)境中考察其穩(wěn)定性,一周后,仍保留響應(yīng)電流值的90%以上,表明該電極具有良好的穩(wěn)定性。

本發(fā)明的工作原理是,本發(fā)明在多孔納米金修飾的電極表面,通過(guò)金硫鍵將適配體固定,再將互補(bǔ)DNA鏈與適配體結(jié)合形成雙鏈DNA,最后將作為電化學(xué)探針的亞甲基藍(lán)嵌入雙鏈DNA中,建立一種底物誘導(dǎo)置換互補(bǔ)DNA鏈的非標(biāo)記型核酸適配體傳感器檢測(cè)雙酚A的方法。

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