[發明專利]構建待測基因組的DNA測序文庫的方法及其應用

有效

• 申請號: 201610245445.5
• 申請日: 2016-04-19
• 公開（公告）號: CN105754995B
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發明（設計）人: 頡偉;張冰潔
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B50/06;C40B60/14;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

本發明提出了一種構建待測基因組的DNA測序文庫的方法，該方法包括：(1)利用微球菌核酸酶對待測基因組進行第一消化處理，以便獲得第一消化處理產物；(2)將所述第一消化處理產物進行免疫共沉淀處理，以便獲得免疫共沉淀處理產物；(3)利用蛋白酶K對所述免疫共沉淀處理產物進行第二消化處理，以便獲得第二消化處理產物；(4)利用蝦堿性磷酸酶對所述第二；消化處理產物直接進行去磷酸化處理，以便獲得去磷酸化處理產物；(5)將所述去磷酸化處理產物直接進行變性處理，以便獲得含有單鏈DNA分子的變性處理產物；以及(6)基于所述含有單鏈DNA分子的變性處理產物，按照TELP法獲得測序文庫。

技術領域

本發明涉及生物技術領域。具體地，本發明涉及構建待測基因組的DNA測序文庫的方法及其應用。更具體地，本發明涉及構建待測基因組的DNA測序文庫的方法、構建待測基因組的DNA測序文庫的設備、確定待測基因組的DNA序列信息的方法、確定待測基因組的DNA序列信息的系統和用于確定待測基因組染色質目標區域的序列信息的方法。

背景技術

近年來在表觀遺傳學領域的研究表明，組蛋白修飾對維持細胞的生長發育有著至關重要的作用。因此，如何獲得不同種類細胞在不同發育階段的系統的全面的組蛋白修飾信息成了亟待解決的問題。而二代測序技術的普及，使得結合測序的染色質免疫共沉淀技術成為了研究DNA與組蛋白相互作用的重要技術手段，為揭示細胞的系統全面的DNA組蛋白修飾圖譜提供了強有力的技術支撐。然而，染色質免疫共沉淀技術極為受限于細胞數目和抗體的質量等多方面的因素，如果不能夠獲得足夠量的用于建庫的DNA，是無法得到有效組蛋白修飾信息的。傳統的染色質免疫共沉淀技術包括交聯、打斷DNA、抗體孵育、解交聯和洗脫DNA等幾個重要步驟，然而傳統的染色質免疫共沉淀技術通常都用于研究容易獲得的、數量級在10⁶以上的常見類型的細胞，對于研究處于胚胎發育早期的這種極難獲得的、少量數目的類型的細胞是無能為力的。

從而，如何建立不易獲得的、少量數量類型細胞的DNA測序文庫并有效用于DNA測序，是有待解決的問題。

發明內容

本申請是基于發明人對以下問題的發現而做出的：

傳統的染色質免疫共沉淀技術中的交聯和斷裂DNA的過程會造成大量的DNA損失，并且后續的幾次純化DNA的過程又使得DNA的回收效率成為了影響獲得的DNA量的關鍵因素。基于發明人對以上傳統染色質免疫共沉淀技術中影響獲得DNA量因素的發現，發明人對傳統的免疫共沉淀技術進行了創造性的改進，提出了一種新的基于染色質免疫共沉淀的建庫和測序技術。該建庫技術和測序技術可對原代細胞或數目低至500的細胞的DNA進行建庫和有效測序，為研究胚胎發育早期的表觀遺傳學的精細調控研究帶來了希望。

在本發明的第一方面，本發明提出了一種構建待測基因組的DNA測序文庫的方法。根據本發明的實施例，該方法包括：(1)利用微球核酸酶對待測基因組進行第一消化處理，以便獲得第一消化處理產物；(2)將所述第一消化處理產物進行免疫共沉淀處理，以便獲得免疫共沉淀處理產物；(3)利用蛋白酶K對所述免疫共沉淀處理產物進行第二消化處理，以便獲得第二消化處理產物；(4)利用蝦堿性磷酸酶對所述第二消化處理產物直接進行去磷酸化處理，以便獲得去磷酸化處理產物；(5)將所述去磷酸化處理產物直接進行變性處理，以便獲得含有單鏈DNA分子的變性處理產物；以及(6)基于所述含有單鏈DNA分子的變性處理產物，按照TELP法獲得測序文庫。