[發明專利]構建待測基因組的DNA測序文庫的方法及其應用

有效

• 申請號: 201610245445.5
• 申請日: 2016-04-19
• 公開（公告）號: CN105754995B
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發明（設計）人: 頡偉;張冰潔
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B50/06;C40B60/14;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

1.一種構建待測基因組的DNA測序文庫的方法，其特征在于，包括：

(1)利用微球菌核酸酶對待測基因組進行第一消化處理，以便獲得第一消化處理產物；

(2)將所述第一消化處理產物進行免疫共沉淀處理，以便獲得免疫共沉淀處理產物，所述免疫共沉淀處理是通過將所述第一消化處理產物與組蛋白抗體進行孵育實現的；

(3)利用蛋白酶K對所述免疫共沉淀處理產物進行第二消化處理，以便獲得第二消化處理產物，所述第二消化處理是通過利用洗脫緩沖液和蛋白酶K對所述免疫共沉淀處理產物進行消化處理實現的，所述第二消化處理后進一步對所述蛋白酶K進行滅活處理；

(4)利用蝦堿性磷酸酶對所述第二消化處理產物直接進行去磷酸化處理，以便獲得去磷酸化處理產物，所述去磷酸化處理是在37攝氏度的條件下進行1小時；

(5)將所述去磷酸化處理產物直接進行熱變性處理，以便獲得含有單鏈DNA分子的變性處理產物；以及

(6)基于所述含有單鏈DNA分子的變性處理產物，按照TELP法獲得測序文庫。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述去磷酸化處理后進一步包括：對所述蝦堿性磷酸酶進行失活處理，所述失活處理是在65攝氏度下進行10分鐘。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述TELP法是通過如下方式實現的：

(6-1)將所述含有單鏈DNA分子的變性處理產物直接進行3’末端修飾處理，以便在所述單鏈DNA分子的3’末端形成poly(C)n尾部，從而獲得具有Poly(C)n尾部的單鏈DNA分子，其中，n代表堿基C的數目，并且n為5～30之間的任意整數；

(6-2)利用延伸引物，基于所述具有Poly(C)n尾部的單鏈DNA分子，獲得雙鏈DNA分子，其中，所述延伸引物在3’末端包括H(G)m單元，H為堿基A、堿基T或堿基C，m為堿基G的數目，并且m為5～15之間的整數；以及

(6-3)在所述雙鏈DNA分子遠離H(G)m單元的一端連接接頭，并對所得到的連接產物進行擴增，以便獲得擴增產物，所述擴增產物構成所述DNA測序文庫。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測基因組是通過裂解細胞或組織而獲得的全基因組或部分基因組。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(1)進一步包括：

(1-1)使所述待測基因組與微球菌核酸酶工作液進行預接觸，以便獲得預接觸后混合物；

(1-2)利用所述微球菌核酸酶對所述接觸后混合物進行所述第一消化處理，以便獲得所述第一消化處理產物；以及

(1-3)利用微球菌核酸酶終止液終止消化處理。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，進一步包括：將所述免疫共沉淀處理產物與攜帶protein A的磁珠接觸。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，進一步包括：利用RIPA緩沖液和氯化鋰緩沖液對所述免疫共沉淀處理產物進行清洗處理。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二消化處理是在55攝氏度的條件下進行1小時。

9.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(6-3)進一步包括：

(6-3-1)將分別由SEQ ID NO：2-3所示核苷酸序列的單鏈核酸分子進行退火，以便獲得半接頭；

(6-3-2)將所述半接頭與所述雙鏈DNA分子的一端進行連接，以便獲得連接有半接頭的雙鏈DNA分子；

(6-3-3)利用由SEQ ID NO：4-7所示的核苷酸作為引物，對所述連接有半接頭的雙鏈DNA分子進行擴增。