[發(fā)明專利]一種人體胃中微生物總DNA的提取方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610243307.3
• 申請日: 2016-04-19
• 公開（公告）號: CN105695451B
• 公開（公告）日: 2019-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳兵;尹金寶;張徐祥;劉蘇
• 申請（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 李倩

本發(fā)明公開了一種人體胃中微生物總DNA的提取方法，本發(fā)明提取方法是在現(xiàn)有提取方法的基礎(chǔ)上加入了對胃提取液的前處理步驟，從而有效解決了由于樣品低pH因素和人體基因組DNA干擾導(dǎo)致的提取效率低和效果差的問題，本發(fā)明的提取方法相較于現(xiàn)有方法其提取效率提高了一倍以上，所提取的微生物DNA濃度高，微生物總DNA占有比例高，16S rRNA v1?v2區(qū)PCR產(chǎn)物條帶明亮清晰，進而能夠更加準(zhǔn)確全面反應(yīng)胃中的微生物狀況，為后續(xù)微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種人體胃中微生物總DNA的提取方法，屬于生物技術(shù)科學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

胃是人體消化系統(tǒng)的重要部分，由于胃酸的分泌使其所包含的微生物成為消化道微生物生態(tài)系統(tǒng)中特殊的一部分，胃中復(fù)雜的微生物群落及其代謝產(chǎn)物與人體的健康和疾病有著密切關(guān)系，在人體能量代謝、營養(yǎng)吸收、免疫系統(tǒng)、胃腸道功能等方面發(fā)揮著重要作用。在胃中微生物的群落結(jié)構(gòu)的研究過程中，微生物總DNA的提取顯得尤為重要。然而由于胃中微生物豐度較低以及低pH的特殊環(huán)境，造成胃中微生物總DNA提取效率低下，并且提取效果差。常見提取方式采用胃粘膜組織作為實驗樣本，配合微生物DNA提取試劑盒進行提取，效率低下，且大部分為胃粘膜組織的人體基因組DNA，極少的部分是微生物的DNA。這樣提取所得的DNA進行后續(xù)的分子生態(tài)學(xué)研究不能全面準(zhǔn)確的反應(yīng)胃中微生物群落結(jié)構(gòu)與功能情況。因此一種能夠有效解決樣品低pH因素以及人體基因組DNA帶來干擾的胃微生物總DNA提取方法的開發(fā)很有必要。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種人體胃中微生物總DNA的提取方法，該方法能夠大幅提高胃中微生物的總DNA提取效率和質(zhì)量。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

一種人體胃中微生物總DNA的提取方法，包括如下步驟：

步驟1，將等體積的胃沖洗液和乙醇溶液混合，于-20℃下靜置一段時間，將靜置后的物料于4℃下離心分離，離心分離后去除上清液，得到固相A；

步驟2，向步驟1的固相A中加入所需量的緩沖液，混合均勻后將混合物料于4℃下進行第一次離心分離，離心分離后去除上清液，保留固相；將所得的固相于4℃下進行第二次離心分離，離心分離后去除上清液，得到固相B；

步驟3，向步驟2的固相B中依次加入所需量的蛋白酶K和緩沖液，混合均勻后于56℃下進行水浴加熱，加熱后得到液相C；

步驟4，將步驟3的液相C使用DNA提取試劑盒進行總DNA的提取，得到總DNA，再使用微量紫外可見分光光度計，進行DNA總含量的測定；

步驟5，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增：PCR擴增16S rRNAv1-v2區(qū)，得到的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，最終得到微生物總DNA的質(zhì)量。

其中，步驟1中，所述胃沖洗液的加入體積為10～20mL，所述乙醇溶液的加入體積為10～20mL，其中，所述乙醇溶液的質(zhì)量百分濃度為100％。

其中，步驟1中，所述離心分離的轉(zhuǎn)速為15000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為10～15分鐘。

其中，步驟2中，所述緩沖液由如下質(zhì)量的組分組成：每1L緩沖液中，含有137mmol氯化鈉、2.7mmol氯化鉀、10mmol磷酸氫二鉀以及2mmol磷酸二氫鉀。

其中，步驟2中，所述緩沖液的加入量為10mL。

其中，步驟2中，所述第一次離心分離的轉(zhuǎn)速為15000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為10～15分鐘；所述第二次離心分離的轉(zhuǎn)速為15000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為5分鐘。

其中，步驟3中，所述蛋白酶K的加入量為20μL，所述緩沖液的加入量為200μL。

其中，步驟3中，所述水浴加熱的時間為60分鐘。