[發明專利]一種人體胃中微生物總DNA的提取方法

有效

• 申請號: 201610243307.3
• 申請日: 2016-04-19
• 公開（公告）號: CN105695451B
• 公開（公告）日: 2019-02-15
• 發明（設計）人: 吳兵;尹金寶;張徐祥;劉蘇
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 李倩

1.一種人體胃中微生物總DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1，將等體積的胃沖洗液和乙醇溶液混合，于-20℃下靜置一段時間，將靜置后的物料于4℃下離心分離，離心分離后去除上清液，得到固相A；

步驟2，向步驟1的固相A中加入所需量的緩沖液，混合均勻后將混合物料于4℃下進行第一次離心分離，離心分離后去除上清液，保留固相；將所得的固相于4℃下進行第二次離心分離，離心分離后去除上清液，得到固相B；所述緩沖液的配方為：每1L緩沖液中，含有137mmol氯化鈉、2.7mmol氯化鉀、10mmol磷酸氫二鉀以及2mmol磷酸二氫鉀；

步驟3，向步驟2的固相B中依次加入所需量的蛋白酶K和緩沖液，混合均勻后于56℃下進行水浴加熱，加熱后得到液相C；

步驟4，將步驟3的液相C使用DNA提取試劑盒進行微生物總DNA的提取，得到總DNA，再使用微量紫外可見分光光度計，進行DNA總含量的測定；

步驟5，聚合酶鏈式反應擴增：PCR擴增16S rRNA v1-v2區，得到的PCR產物采用瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，最終得到微生物總DNA的質量。

2.根據權利要求1所述的人體胃中微生物總DNA的提取方法，其特征在于：步驟1中，所述胃沖洗液的加入體積為10～20mL，所述乙醇溶液的加入體積為10～20mL，其中，所述乙醇溶液的質量百分濃度為100％。

3.根據權利要求1所述的人體胃中微生物總DNA的提取方法，其特征在于：步驟1中，所述離心分離的轉速為15000轉/分鐘，離心時間為10～15分鐘。

4.根據權利要求1所述的人體胃中微生物總DNA的提取方法，其特征在于：步驟2中，所述緩沖液的加入量為10mL。

5.根據權利要求1所述的人體胃中微生物總DNA的提取方法，其特征在于：步驟2中，所述第一次離心分離的轉速為15000轉/分鐘，離心時間為10～15分鐘；所述第二次離心分離的轉速為15000轉/分鐘，離心時間為5分鐘。

6.根據權利要求1所述的人體胃中微生物總DNA的提取方法，其特征在于：步驟3中，所述蛋白酶K的加入量為20μL，所述緩沖液的加入量為200μL。

7.根據權利要求1所述的人體胃中微生物總DNA的提取方法，其特征在于：步驟3中，所述水浴加熱的時間為60分鐘。

8.根據權利要求1所述的人體胃中微生物總DNA的提取方法，其特征在于：步驟5中，16SrRNA v1-v2引物為：

27F-5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和

338R-5’GCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNCATGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’。

9.根據權利要求1所述的人體胃中微生物總DNA的提取方法，其特征在于：步驟5中，所述瓊脂糖凝膠的質量百分濃度為1％。