[發(fā)明專利]microRNA-126-5p在心肌損傷中的表達(dá)檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610243189.6
• 申請(qǐng)日: 2016-04-19
• 公開（公告）號(hào): CN105695612A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣碧梅;梁鵬飛;肖獻(xiàn)忠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京世譽(yù)鑫誠(chéng)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11368
• 代理人: 郭官厚

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及microRNA-126-5p在心肌損 傷中的表達(dá)檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

microRNA是近年發(fā)現(xiàn)的下的、內(nèi)源性的單鏈非編碼RNA，由18-25 個(gè)核苷酸組成，由一段具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度為70-80核苷酸的單鏈 RNA前體剪切后生成。人類基因組被檢測(cè)出大約有1000種microRNA。 microRNA在各種病理應(yīng)激條件下表達(dá)明顯改變，充分顯示了它們?cè)? 各種疾病中所發(fā)揮的作用。

近年來(lái)隨著microRNA的發(fā)現(xiàn)，又將心肌缺血損傷與保護(hù)的研究 推向深入，科研人員發(fā)現(xiàn)microRNA在心肌缺血損傷中發(fā)揮著重要的 作用。

但是，現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于microRNA的表達(dá)檢測(cè)方法不夠成熟，檢 測(cè)的結(jié)果不夠直觀。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種 microRNA-126-5p在心肌損傷中的表達(dá)檢測(cè)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下技術(shù)方案：

microRNA-126-5p在心肌損傷中的表達(dá)檢測(cè)方法，包括如下步驟：

S1.從-80℃中取出已收集好的心肌組織標(biāo)本，用Trizol提取組 織中RNA；

S2.逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA：根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑配制反應(yīng)液，并對(duì)反應(yīng) 液進(jìn)行稀釋，取稀釋液加入到下一步的RealTimePCR反應(yīng)體系中， 進(jìn)行定量檢測(cè)；

S3.RT-QPCR定量檢測(cè)：配制PCR反應(yīng)液，進(jìn)行RealTimePCR 反應(yīng)，包括

S3.1對(duì)DNA進(jìn)行95℃、30S預(yù)變性處理；

S3.2進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃、5S,60℃、34S,進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。

進(jìn)一步的，所述步驟S1中，用Trizol提取組織中RNA步驟為：

S1.1將標(biāo)本從-80℃取出后迅速放置液氮中速凍，用經(jīng)過(guò)高溫滅 酶的研缽研磨至成粉末狀后在轉(zhuǎn)移至無(wú)酶EP管中；

S1.2每個(gè)標(biāo)本中加入1000體積份數(shù)的Trizol裂解組織，室溫 放置2-5min；

S1.3加入200體積份數(shù)的三氯甲烷，上下倒置混勻15s，充分混 勻后靜置10min，于4℃冷室中以12000rpm離心15min；

S1.4輕輕吸取上清液至另一1500體積份數(shù)的無(wú)酶EP管中，加 入同體積的異丙醇，上下倒置混勻15s，靜置10min，于4℃冷室中 以12000rpm離心10min；

S1.5倒掉上清液，加入1000體積份數(shù)的75％的乙醇洗滌沉淀， 沉淀?xiàng)l件為置于4℃冷室中以7500rpm離心5min；

S1.6加入20體積份數(shù)的無(wú)酶水溶液沉淀。

進(jìn)一步的，所述步驟S1.6中，加入20體積份數(shù)的無(wú)酶水溶液沉 淀后，置于55℃水浴鍋中助溶。

進(jìn)一步的，所述步驟S2中，逆轉(zhuǎn)錄cDNA具體步驟如下：

S2.1配制反應(yīng)液：將10體積份數(shù)的2倍濃度miRNA反應(yīng)混合物、 2體積份數(shù)的0.1％牛血清蛋白、2體積份數(shù)的miRNAPrimeScript逆 轉(zhuǎn)錄酶混合物、1體積份數(shù)的總RNA和20體積份數(shù)的無(wú)RNA酶蒸餾 水配置成反應(yīng)液；

S2.2在37℃下進(jìn)行60min的PolyA加尾和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，之后在 85℃下進(jìn)行5sec的酶的失活反應(yīng)；

S2.向得到的RT反應(yīng)液中添加無(wú)RNA酶蒸餾水補(bǔ)足至100體積份 數(shù)，取2體積份數(shù)的稀釋液加入到下一步的RealTimePCR反應(yīng)體系 中，進(jìn)行定量檢測(cè)。

進(jìn)一步的，配制反應(yīng)液均在冰上進(jìn)行。

進(jìn)一步的，所述步驟S3中，配制PCR反應(yīng)液包括：

10體積份數(shù)、2倍濃度的SYBRPremixExTapII，終濃度為1 倍濃度；

0.8體積份數(shù)、10μM的PCRForwardPrimer，終濃度為0.4μM；

0.8體積份數(shù)、10μM的Uni-miRqPCRPrimer，終濃度為0.4 μM；

0.4體積份數(shù)、50倍濃度的ROXReferenceDyeII，終濃度為1 倍濃度；

2體積份數(shù)的模板cDNA溶液；

6體積份數(shù)的dH₂O。