[發明專利]microRNA-126-5p在心肌損傷中的表達檢測方法

在審

• 申請號: 201610243189.6
• 申請日: 2016-04-19
• 公開（公告）號: CN105695612A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 蔣碧梅;梁鵬飛;肖獻忠
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京世譽鑫誠專利代理事務所(普通合伙) 11368
• 代理人: 郭官厚

1.microRNA-126-5p在心肌損傷中的表達檢測方法，其特征在于， 包括如下步驟：

S1.從-80℃中取出已收集好的心肌組織標本，用Trizol提取組 織中RNA；

S2.逆轉錄RNA為cDNA：根據逆轉錄試劑配制反應液，并對反應 液進行稀釋，取稀釋液加入到下一步的RealTimePCR反應體系中， 進行定量檢測；

S3.RT-QPCR定量檢測：配制PCR反應液，進行RealTimePCR 反應，包括

S3.1對DNA進行95℃、30S預變性處理；

S3.2進行PCR反應，反應條件為95℃、5S,60℃、34S,進行40 個循環。

2.根據權利要求1所述的microRNA-126-5p在心肌損傷中的表達 檢測方法，其特征在于，所述步驟S1中，用Trizol提取組織中RNA 步驟為：

S1.1將標本從-80℃取出后迅速放置液氮中速凍，用經過高溫滅 酶的研缽研磨至成粉末狀后在轉移至無酶EP管中；

S1.2每個標本中加入1000體積份數的Trizol裂解組織，室溫 放置2-5min；

S1.3加入200體積份數的三氯甲烷，上下倒置混勻15s，充分混 勻后靜置10min，于4℃冷室中以12000rpm離心15min；

S1.4輕輕吸取上清液至另一1500體積份數的無酶EP管中，加 入同體積的異丙醇，上下倒置混勻15s，靜置10min，于4℃冷室中 以12000rpm離心10min；

S1.5倒掉上清液，加入1000體積份數的75％的乙醇洗滌沉淀， 沉淀條件為置于4℃冷室中以7500rpm離心5min；

S1.6加入20體積份數的無酶水溶液沉淀。

3.根據權利要求2所述的microRNA-126-5p在心肌損傷中的表達 檢測方法，其特征在于，所述步驟S1.6中，加入20體積份數的無酶 水溶液沉淀后，置于55℃水浴鍋中助溶。

4.根據權利要求1所述的microRNA-126-5p在心肌損傷中的表達 檢測方法，其特征在于，所述步驟S2中，逆轉錄cDNA具體步驟如下：

S2.1配制反應液：將10體積份數的2倍濃度miRNA反應混合物、 2體積份數的0.1％牛血清蛋白、2體積份數的miRNAPrimeScript逆 轉錄酶混合物、1體積份數的總RNA和20體積份數的無RNA酶蒸餾 水配置成反應液；

S2.2在37℃下進行60min的PolyA加尾和反轉錄反應，之后在 85℃下進行5sec的酶的失活反應；

S2.向得到的RT反應液中添加無RNA酶蒸餾水補足至100體積份 數，取2體積份數的稀釋液加入到下一步的RealTimePCR反應體系 中，進行定量檢測。

5.根據權利要求1所述的microRNA-126-5p在心肌損傷中的表達 檢測方法，其特征在于，配制反應液均在冰上進行。

6.根據權利要求1所述的microRNA-126-5p在心肌損傷中的表達 檢測方法，其特征在于，所述步驟S3中，配制PCR反應液包括：

10體積份數、2倍濃度的SYBRPremixExTapII，終濃度為1 倍濃度；

0.8體積份數、10μM的PCRForwardPrimer，終濃度為0.4μM；

0.8體積份數、10μM的Uni-miRqPCRPrimer，終濃度為0.4 μM；

0.4體積份數、50倍濃度的ROXReferenceDyeII，終濃度為1 倍濃度；

2體積份數的模板cDNA溶液；

6體積份數的dH₂O。