[發(fā)明專利]一種基于殼聚糖-石墨烯/金納米顆粒復(fù)合膜的電化學DNA傳感器的制備及應(yīng)用的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610240528.5
• 申請日: 2016-04-19
• 公開（公告）號: CN105784822B
• 公開（公告）日: 2019-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李光九;鄭雯;劉俐華;王秀麗;陳瑋;王文成;孫偉
• 申請（專利權(quán)）人: 青島科技大學
• 主分類號: G01N27/48
• 分類號: G01N27/48;G01N27/30
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 于躍

本發(fā)明公開了一種利用金納米顆粒(AuNPs)和殼聚糖(CTS)?石墨烯(GR)復(fù)合膜修飾的離子液體碳糊電極(CILE)，以此為平臺構(gòu)建了一種新型電化學DNA傳感器，并將其應(yīng)用于金黃色葡萄球菌特征基因序列的測定。將離子液體1?己基吡啶六氟磷酸鹽與石墨粉以一定的比例混合制得CILE，探針ssDNA序列通過靜電吸附固定在CTS?GR/AuNPs/CILE上后與目標ssDNA序列雜交，以亞甲基藍為指示劑來檢測與目標序列的雜交反應(yīng)。實驗結(jié)果表明復(fù)合材料具有大的比表面積和良好的導(dǎo)電性，能夠增加ssDNA探針的負載量，從而有效地提高電化學響應(yīng)信號。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新型納米復(fù)合材料修飾電極的電化學DNA傳感器的制備及應(yīng)用的方法

背景技術(shù)

DNA電化學生物傳感器是一種以ssDNA作為識別元件，通過DNA序列雜交進行分子識別的生物傳感器，它能夠?qū)⒛繕藄sDNA序列的存在轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓹z測的電信號。與傳統(tǒng)的標記基因檢測技術(shù)相比較，DNA電化學生物傳感器具有更為快速、簡便、無污染等特點，并且避免了不能定量和受到污染導(dǎo)致假陽性的問題。此外DNA分子識別層十分穩(wěn)定且易于再生，這使得DNA電化學生物傳感器在基因分析領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測、藥物研發(fā)等領(lǐng)域。電化學ssDNA傳感器制備的主要步驟如下：(1)將探針ssDNA序列固定在電極表面；(2)與目標ssDNA序列進行雜交；(3)雜交反應(yīng)的指示；(4)雜交信號的電化學檢測。其中最為關(guān)鍵的步驟是探針ssDNA的固定和雜交反應(yīng)的電化學檢測，探針ssDNA在電極表面的固定量和雜交反應(yīng)的檢測方法會影響電化學傳感器的靈敏度。

碳糊電極是利用導(dǎo)電性的石墨粉與憎水性的粘合劑混制成糊狀物，然后填充在電極管中而制成的一類碳電極，它具有制備簡單、價格便宜、選擇性好、靈敏度高、電位適用范圍寬及表面易于更新等優(yōu)點，室溫離子液體是指在室溫及鄰近溫度下完全由陰陽離子組成的液體物質(zhì)，具有電化學窗口寬、導(dǎo)電率高、熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性好等優(yōu)點。離子液體可以作為粘合劑與石墨粉混合制備離子液體修飾碳糊電極(CILE)，離子液體的存在能夠有效地改變傳統(tǒng)碳糊電極的性能，既可以增加碳糊電極的穩(wěn)定性，又可以增加導(dǎo)電效率。

納米材料具有比表面積大、生物兼容性好及導(dǎo)電性好等特點，常被應(yīng)用于DNA電化學生物傳感器的構(gòu)建。金納米粒子具有較好的導(dǎo)電能力，能夠起到導(dǎo)線或者導(dǎo)電通道的作用，加速生物分子與電極間的電子轉(zhuǎn)移，能夠加快異相界面的電子傳遞速率。納米金修飾電極可以增大電極的有效面積，用于制備DNA傳感器時可以提高DNA固定量。

石墨烯(graphene,GR)是以sp²雜化連接的新型二維單層碳原子層晶體，其獨特的二維結(jié)構(gòu)可以作為生物分子和納米材料的負載體。由于它具有電化學窗口寬、穩(wěn)定性高、比表面積大、電催化活性高、導(dǎo)電性好等優(yōu)點，在電化學傳感器有著重要的應(yīng)用前景。

殼聚糖是一種大量存在于自然界的天然高分子，具有無毒、成膜能力強、生物相容性好、高強度、高附著能力等優(yōu)點，其表面大量氨基的存在能夠與DNA分子發(fā)生靜電吸附作用，而被大量用于制備電化學DNA生物傳感器。

電化學沉積法是在含有要沉積離子的溶液中，通過改變電化學條件，如改變電位或者沉積時間將要沉積離子均勻的沉積在陰極或者陽極模板上。電化學沉積法有以下優(yōu)點如：常溫下就可以發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)溫度低；通過監(jiān)控轉(zhuǎn)移的電荷數(shù)可以控制沉積薄膜的厚度；其組成和缺陷可以控制；可以在各種復(fù)雜形狀的基底上沉積薄膜；可以進行非平衡相的沉積；驅(qū)動力可以進行精確的控制；耗費小等優(yōu)點。電化學沉積法根據(jù)沉積電壓和電流方式的不同，可以分為恒流電沉積法，恒壓電沉積法，脈沖電沉積法，循環(huán)伏安法等。

金黃色葡萄球菌在自然界中廣泛存在，它是一種重要的致病微生物，由金黃色葡萄球菌感染可引起多種疾病，包括食物中毒、假膜性腸炎、燙傷皮膚綜合癥、毒素休克綜合癥、化膿性炎癥和敗血癥等，會給人類健康造成了極大的威脅和損失。目前金黃色葡萄球菌的檢測方法大致包括傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法及生化鑒定、免疫學方法、熒光定量PCR法、熒光原位雜交法(FISH)以及基因芯片法等。