[發明專利]一種基于殼聚糖-石墨烯/金納米顆粒復合膜的電化學DNA傳感器的制備及應用的方法

有效

• 申請號: 201610240528.5
• 申請日: 2016-04-19
• 公開（公告）號: CN105784822B
• 公開（公告）日: 2019-02-26
• 發明（設計）人: 李光九;鄭雯;劉俐華;王秀麗;陳瑋;王文成;孫偉
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: G01N27/48
• 分類號: G01N27/48;G01N27/30
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 于躍

1.一種基于殼聚糖-石墨烯/金納米顆粒復合修飾電極的電化學DNA傳感器在金黃色葡萄球菌特征序列檢測方面的應用，其特征在于

所述電化學DNA傳感器的制備方法包括如下步驟：

(1)石墨粉與離子液體正己基吡啶六氟磷酸鹽以一定比例混合研磨均勻得到離子液體修飾碳糊，然后將離子液體修飾碳糊填入玻璃電極管中壓實，內插銅線作為導線，可得到離子液體修飾碳糊電極(CILE)；

(2)將氯金酸和硝酸鈉溶液以一定比例混合制備電解液，CILE為工作電極，鉑片為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極，利用恒電位沉積法在CILE表面得到金納米顆粒，用蒸餾水清洗后得到AuNPs/CILE，真空干燥后備用；

(3)將8.0μL CTS-GR復合材料的分散液涂于AuNPs/CILE表面，晾干后得到修飾電極CTS-GR/AuNPs/CILE；

(4)在CTS-GR/AuNPs/CILE電極表面均勻滴涂含有探針ssDNA序列的緩沖溶液，自然晾干后分別使用0.5％十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液和二次蒸餾水沖洗3次，以除去未吸附的探針ssDNA序列，即可得到固定有探針序列的電極ssDNA/CTS-GR/AuNPs/CILE；

步驟(1)所述玻璃電極管內徑為3mm～5mm，兩端用砂紙80^#～1200^#打磨光滑，所述研磨的時間為1.5h～3h，石墨粉與離子液體正己基吡啶六氟磷酸鹽的質量比為2：1；

步驟(2)中氯金酸的濃度為3.0mmol/L，硝酸鈉的濃度為0.1mol/L，恒電位沉積法的沉積電位為-0.2V(vs.SCE)，沉積時間為30s；

步驟(3)中CTS-GR復合材料的分散液由1.0mg GR超聲分散在1.0mL殼聚糖中得到；

步驟(4)中在電極表面滴涂含有1.0×10^-6mol/L的探針ssDNA序列的PBS緩沖溶液，PBS緩沖溶液的濃度為50.0mmol/L，pH為7.0，滴涂量為10.0μL；所述探針ssDNA的序列是5'-TGGACG TGG CTTAGC GTATAT T-3'；

所述應用包括以下步驟：

(1)將不同修飾電極浸入亞甲基藍(MB)溶液中吸附一定時間，取出后依次用0.5％SDS溶液和二次蒸餾水充分洗滌，以除去表面吸附的MB，使用示差脈沖伏安法(DPV)研究MB在不同修飾電極上的電化學行為；所述不同修飾電極分別為ssDNA/CTS/CILE，ssDNA/CTS/AuNPs/CILE，ssDNA/CTS-GR/CILE，ssDNA/CTS-GR/AuNPs/CILE，dsDNA/CTS-GR/AuNPs/CILE；

(2)將含有不同濃度的目標序列的PBS緩沖溶液直接滴涂在ssDNA/CTS-GR/AuNPs/CILE表面，雜交后分別用0.5％的SDS溶液和二次蒸餾水沖洗，以除去未雜交的目標序列，將雜交后的電極浸入MB溶液中吸附一定時間，取出后依次用0.5％SDS溶液和二次蒸餾水充分洗滌，使用示差脈沖伏安法(DPV)測定還原峰電流變化，得到互補ssDNA濃度與電流值變化大小的標準工作曲線，以研究電化學DNA傳感器的靈敏度；所述目標序列的不同濃度為0，1.0×10^-13，1.0×10^-12，1.0×10^-11，1.0×10^-10，1.0×10^-9，1.0×10^-8，1.0×10^-7和1.0×10^-6mol/L；

(3)將ssDNA/CTS-GR/AuNPs/CILE與不同的ssDNA序列雜交，將雜交后的電極浸入MB溶液中吸附一定時間，取出后依次用0.5％SDS溶液和二次蒸餾水充分洗滌，使用示差脈沖伏安法(DPV)測定并記錄MB的響應電流來研究所構建的DNA傳感器的選擇性；所述不同的ssDNA序列分別為非互補ssDNA序列、三堿基錯配ssDNA序列、單堿基錯配ssDNA序列和互補目標ssDNA序列；

互補目標ssDNA序列：5'-AATATA CGC TAA GCCACG TCCA-3'；

單堿基錯配ssDNA序列：5'-AAGATACGC TAA GCCACG TCC A-3'；

三堿基錯配ssDNA序列：5'-AAGATACGC TAC GCCACG TCTA-3'；

非互補ssDNA序列：5'-GCG GTT GAATCG GCGATG GGT G-3'。