[發明專利]一種高效穩定的單組份酶聯免疫顯色液及其制備方法

有效

• 申請號: 201610239243.X
• 申請日: 2016-04-18
• 公開（公告）號: CN105823871B
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發明（設計）人: 楊勇;劉永雙
• 申請（專利權）人: 蘇州新賽美生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙)11411
• 代理人: 劉剛

技術領域

本發明涉及一種高效穩定的單組份酶聯免疫顯色液及其制備方法。

背景技術

酶聯免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay)，簡稱ELISA，是一種在免疫學反應基礎上，將抗原-抗體的專一性反應和酶對底物高效催化作用相結合發展起來的一種高效簡便的定性和定量的檢測方法。由于ELSIA檢測方法簡單、靈敏度高、快速等優點，自發明以來使其技術得到迅速發展，已被廣泛地應用于各種生命科學和醫藥科學的許多領域。ELISA最終的檢驗方法有多種，但最常見的都是通過酶結合物和顯色液進行反應來判定的。辣根過氧化物酶是ELSIA實驗中應用最廣泛的，其偶聯在抗體上，能通過反應底物過氧化物(如過氧化氫)和顯色劑發生化學反應。目前該顯色劑系統中有多種，但最常見的是3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺(TMB)。

TMB是一種新型安全的過氧化物酶底物，其含有脂溶性較強的基團，易形成多聚體，和HRP活性部位反應，可產生一種可溶性的藍色產物，目視對比明顯。TMB性質穩定，在過氧化物做底物時和HRP反應后，應用HCl或者H₂SO₄終止后，TMB產物由藍色呈黃色，在比色計中可定量，最佳吸收波長為450nm，通過測定吸光值，我們可以定量地判斷免疫反應強度。

目前國內市場上的ELISA試劑盒還多采用雙組份TMB顯色液底物，分為A液和B液，A液中主要成為TMB，B液組要成為是過氧化物，使用前需將A液和B液等體積混勻。還有部分TMB顯色液由多種組分組成，要現配現用才可。這些使用過程中有許多明顯的缺點：操作比較繁瑣，使用不方便；每次配制都會有差異發生，從而導致批次差異大，影響準確的結果；因為多種成分分開存在，在包裝運輸等方面都會增加成本等。目前市場上有些廠家生產的單組份TMB顯色液，因TMB顯色液如果沒有穩定劑等存在，長時間保存會導致穩定性不高，保存時間較短，靈敏度低，顯色背景高，而且進口的TMB顯色液價格貴等缺點。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術的缺陷，提供一種單一組分的，且高效穩定的單組份酶聯免疫顯色液(TMB顯色液)及其制備方法，能夠顯著提高TMB顯色液的長期保存時間。

為了解決上述技術問題，本發明提供了如下的技術方案：

本發明一種高效穩定的單組份酶聯免疫顯色液，其包括以下各組分：

聚乙烯醇的質量分數為0.1％-0.4％；核糖的濃度為10-100mM；檸檬酸的質量分數為0.1-0.5％；乙二酸四乙酸的質量分數為0.2-0.6％；高硼酸鈉的質量分數為0.01-0.05％；TMB的質量分數為0.01-0.05％。

進一步地，包括以下各組分：

聚乙烯醇的質量分數為0.1％；核糖的濃度為10mM；檸檬酸的質量分數為0.1％；乙二酸四乙酸的質量分數為0.2％；高硼酸鈉的質量分數為0.01％；TMB的質量分數為0.01％。

進一步地，包括以下各組分：

聚乙烯醇的質量分數為0.4％；核糖的濃度為100mM；檸檬酸的質量分數為0.5％；乙二酸四乙酸的質量分數為0.6％；高硼酸鈉的質量分數為0.05％；TMB的質量分數為0.05％。

進一步地，包括以下各組分：

聚乙烯醇的質量分數為0.25％；核糖的濃度為75mM；檸檬酸的質量分數為0.21％；乙二酸四乙酸的質量分數為0.42％；高硼酸鈉的質量分數為0.03％；TMB的質量分數為0.025％。

本發明的另一個方面公開了一種高效穩定的單組份酶聯免疫顯色液的制備方法，具體包括以下步驟：

(1)制備含TMB的N-甲基吡咯烷酮溶液：取20ml N-甲基吡咯烷酮為溶劑，緩慢加入0.1g-0.5g的TMB，在磁力攪拌器上攪拌均勻使其充分溶解；

(2)在1000ml的燒杯中，加入800ml雙蒸水，緩慢加入1-4g的聚乙烯醇，加入核糖10-100mM，加入檸檬酸1-5g；加入乙二酸四乙酸2-6g，加入高硼酸鈉0.1-0.5g，攪拌使其充分溶解。

(3)將含TMB的N-甲基吡咯烷酮溶液加入到上述1000ml燒杯中，充分攪拌均勻，定容至1000ml；經0.45um的濾膜過濾，獲得均一的溶液，保存在棕色的塑料瓶中，密封避光保存在2-8℃環境下。

本發明的另一個方面公開了一種高效穩定的單組份酶聯免疫顯色液的使用方法，具體包括以下步驟：