[發(fā)明專利]雞傳染性支氣管炎病毒nsp5 ELISA抗體檢測試劑盒及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610239101.3
• 申請日: 2016-04-16
• 公開（公告）號: CN105785049A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 廖敏;雷靜;周繼勇;顏焰;金玉蘭
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫學(xué)檢測方法領(lǐng)域，具體涉及以傳染性支氣管炎病毒nsp5蛋白為包 被抗原的ELISA抗體檢測試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

雞的傳染性支氣管炎(Infectiousbronchitis,IB)是由傳染性支氣管炎病毒 (InfectiousbronchitisVirus,IBV)引起的雞急性、高度接觸性傳染病。以呼吸困難、腎 炎和蛋品質(zhì)下降為主要特征，該病在全世界廣泛流行，是養(yǎng)雞業(yè)中危害最嚴(yán)重的呼吸道傳 染病之一。IBV基因組長約為27.4kb，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白(S、M、N、E)、15種非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp2- nsp16)以及3a、3b、5a和5b4個附屬蛋白。由于IBVRNA特有的轉(zhuǎn)錄機制，加上RNA酶缺乏校 正系統(tǒng)導(dǎo)致IBV很容易發(fā)生變異，出現(xiàn)了復(fù)雜的組織嗜性、血清型和基因型。IBV新的變異株 的不斷出現(xiàn)和新的血清型的不斷增加，給IB的診斷和防治帶來很大的困難。

快速、準(zhǔn)確地診斷IB，檢測雞群中抗體水平，對于了解雞群中IB的流行情況、適時 調(diào)整免疫程序，有效防制IB都有至關(guān)重要的作用。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)由于其簡單、 快速、敏感、經(jīng)濟(jì)和適于大規(guī)模使用的特點在臨床上得到廣泛應(yīng)用。在IBV抗體檢測方面，僅 有美國IDEXX公司生產(chǎn)的商品化試劑盒比較可信，主要用于國內(nèi)大型養(yǎng)雞場中IBV抗體水平 的抽檢以及研發(fā)部門開發(fā)同類型新產(chǎn)品的比對試驗。但由于進(jìn)口試劑比較昂貴，限制了該 試劑盒在國內(nèi)的廣泛使用。

同源性分析表明，編碼IBV非結(jié)構(gòu)蛋白的基因序列相對于結(jié)構(gòu)蛋白的基因序列具 有較高的穩(wěn)定性，涉及抗原表位的突變概率較低。所以利用IBV非結(jié)構(gòu)蛋白作為抗原檢測 IBV血清抗體，具有對不同血清型，或者不同組織嗜性的毒株均有通用性的潛力。此外，由于 非結(jié)構(gòu)蛋白不參與病毒粒子的組成，因此，以非結(jié)構(gòu)蛋白作為檢測抗原同時也具有區(qū)分滅 活疫苗免疫和活毒感染的潛力。非結(jié)構(gòu)蛋白5(nsp5)是一種蛋白水解酶，其在多聚蛋白pp1a 和pp1ab的水解中非常重要，也被叫做主要蛋白酶Mpro。其活性的喪失直接影響病毒的復(fù) 制，導(dǎo)致病毒增殖失敗。在冠狀病毒屬中nsp5的結(jié)構(gòu)和功能均保守。因此，建立基于IBV非結(jié) 構(gòu)蛋白的ELISA抗體檢測方法具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，尚未有利用IBV的非結(jié)構(gòu)蛋白作為檢測抗原的血清學(xué)檢測方法的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用于雞傳染性支 氣管炎抗體檢測試劑盒，為臨床IB的診斷和抗體水平的檢測提供經(jīng)濟(jì)實用可靠的檢測工 具。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是：

提供一種雞傳染性支氣管炎病毒nsp5ELISA抗體檢測試劑盒，該試劑盒包括：

(1)由重組表達(dá)的IBV非結(jié)構(gòu)蛋白5包被的96孔酶聯(lián)反應(yīng)板；

(2)用樣品稀釋液稀釋的IgG酶標(biāo)抗體溶液，所述酶標(biāo)抗體為辣根過氧化物酶 (HRP)標(biāo)記的羊抗雞IgG抗體；

(3)封閉液：含10％犢牛血清的PBS；

(4)洗滌液：含0.05％Tween-20的PBS(即PBST)；

(5)樣品稀釋液：含5％脫脂奶的PBST；

(6)陽性對照樣品：抗IBVnsp5雞血清；

(7)陰性對照樣品：陰性SPF雞血清；

(8)顯色液：A液為底物溶液，含0.1mg/ml四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液，B液為0.05％ H₂O₂，使用前將A液和B液1:1混合；

(9)終止液：2MH₂SO₄；

所述重組表達(dá)的IBV非結(jié)構(gòu)蛋白5通過下述方法制備獲得：

IBVnsp5的基因經(jīng)RT-PCR方法擴(kuò)增獲得后，將其克隆到原核表達(dá)載體pEGX-4T-1 中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；篩選攜帶IBVnsp5基因的重組菌，在IPTG誘導(dǎo)下大量表達(dá)與GST融合的 nsp5重組蛋白；利用GSTrapFF親和層析柱純化，獲得提純后的IBVnsp5重組蛋白，保存于- 20℃?zhèn)溆茫?

所述IBVnsp5的基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；IBVnsp5的基因編碼的 氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了前述試劑盒的使用方法，包括以下步驟：