[發(fā)明專利]雞傳染性支氣管炎病毒nsp5 ELISA抗體檢測試劑盒及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610239101.3
• 申請日: 2016-04-16
• 公開（公告）號: CN105785049A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 廖敏;雷靜;周繼勇;顏焰;金玉蘭
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

1.雞傳染性支氣管炎病毒nsp5ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括：

(1)由重組表達(dá)的IBV非結(jié)構(gòu)蛋白5包被的96孔酶聯(lián)反應(yīng)板；

(2)用樣品稀釋液稀釋的IgG酶標(biāo)抗體溶液，所述酶標(biāo)抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊 抗雞IgG抗體；

(3)封閉液：含10％犢牛血清的PBS；

(4)洗滌液：含0.05％Tween-20的PBS；

(5)樣品稀釋液：含5％脫脂奶的PBST；

(6)陽性對照樣品：抗IBVnsp5雞血清；

(7)陰性對照樣品：陰性SPF雞血清；

(8)顯色液：A液為底物溶液，含0.1mg/ml四甲基聯(lián)苯胺溶液，B液為0.05％H₂O₂，使用前 將A液和B液1:1混合；

(9)終止液：2MH₂SO₄；

所述重組表達(dá)的IBV非結(jié)構(gòu)蛋白5通過下述方法制備獲得：

IBVnsp5的基因經(jīng)RT-PCR方法擴(kuò)增獲得后，將其克隆到原核表達(dá)載體pEGX-4T-1中，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌；篩選攜帶IBVnsp5基因的重組菌，在IPTG誘導(dǎo)下大量表達(dá)與GST融合的nsp5重 組蛋白；利用GSTrapFF親和層析柱純化，獲得提純后的IBVnsp5重組蛋白，保存于-20℃?zhèn)? 用；

所述IBVnsp5的基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；IBVnsp5的基因編碼的氨基 酸序列如SEQIDNO：2所示。

2.權(quán)利要求1中所述試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)IBVnsp5包被的96孔酶聯(lián)反應(yīng)板的制備：

將重組的IBVnsp5蛋白經(jīng)BCA蛋白檢測試劑盒測定濃度后，用pH為7.4的0.01MPBS緩 沖液作為包被液，將其稀釋到終濃度為3.64μg/ml；然后按100μl/孔的量加入到96孔酶聯(lián)反 應(yīng)板中，于37℃孵育2h或4℃孵育過夜，得到酶聯(lián)反應(yīng)板；

(2)封閉：去掉酶聯(lián)反應(yīng)板的包被液后，加入200μl/孔的封閉液，37℃孵育1小時，用 PBST洗板一次；

(3)一抗孵育：加入100μl/孔用稀釋液以1:200稀釋的待檢血清，同時設(shè)置陽性和陰性 血清對照；37℃孵育1小時，PBST洗板5次；

(4)二抗孵育：加入100μl/孔用稀釋液以1:1000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG二抗，37℃ 孵育45分鐘，PBST洗板5次；

(5)顯色：顯色A液和B液等體積混合后，以100μl/孔加入反應(yīng)孔，在黑暗處顯色10分鐘；

(6)終止：加入50μl/孔終止液；

(7)結(jié)果判定：

酶標(biāo)儀測定OD450nm讀數(shù)，按下述公式計算S/P值：

S/P值＝(待測樣本OD450nm均值-陰性對照OD450nm均值)/(陽性對照孔OD450nm均值- 陰性對照OD450nm均值)；

如血清樣品的S/P值大于0.12，判為IBV抗體陽性，反之則判為陰性。