[發明專利]一種高通量的多重富集定量PCR(ME-qPCR)檢測轉基因作物元件及品系的方法

有效

• 申請號: 201610237272.2
• 申請日: 2016-04-15
• 公開（公告）號: CN105779611B
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發明（設計）人: 付偉;吳希陽;魏霜;劉津;朱鵬宇;王晨光;林春貴;朱水芳
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

本發明涉及分子生物學，具體公開了一種檢測轉基因作物的方法，針對轉基因作物的內源基因、外源基因和轉基因品系旁臨序列設計內、外引物，先將所有內、外引物混合，進行第一輪循環數較少(15cycles)的高通量多重富集PCR，再運用內引物進行第二輪熒光定量PCR，結果根據擴增曲線和熔融曲線分析，顯著增加了所述方法的成功率和穩定性，可實現高通量檢測轉基因作物的目的。本發明所述方法的靈敏度高于普通熒光定量PCR約1個數量級；擁有和普通熒光定量PCR相同的定量能力；特異性強，為轉基因作物的檢測提供了更有效的方法。

技術領域

本發明涉及分子生物學，具體地說，涉及一種高通量檢測轉基因作物的方法。

背景技術

在轉基因檢測中，以核酸為基礎的檢測方法因其穩定性強、特異性高得到廣泛的應用，其中以PCR為基礎的檢測方法尤為重要。PCR為基礎的檢測方法主要包括普通PCR和熒光定量PCR，熒光定量PCR因其無需凝膠電泳、特異性強等特點，在實際檢測中應用廣泛。但檢測通量一直是以PCR為基礎的檢測方法的一個瓶頸，例如，多重PCR因引物之間容易形成引物二聚體，且引物之間易存在競爭，這導致多重PCR的檢測通量不高；而多重熒光定量PCR由于儀器檢測熒光通路的限制及引物探針之間的競爭，也難以實現高通量。如何將高通量檢測與熒光定量PCR結合起來，建立一種新型的高通量熒光定量PCR檢測方法顯得很有必要。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種高通量檢測轉基因作物的方法。

為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：

第一方面，本發明提供一種檢測轉基因作物的方法，包括如下步驟：

(1)針對待測樣品的內源基因、外源基因及轉基因品系旁臨序列，各設計內引物對和外引物對；

(2)篩選特異性高、靈敏度高的內引物對和外引物對；保證外引物產物大小約為100-200bp，內引物產物大小約為50-100bp；調整所有內外引物Tm值基本一致以保證在同一退火溫度下均能順利擴增；

(3)提取待測樣品DNA，以待測樣品DNA作為模板，利用步驟(2)篩選得到的內外引物對一同進行PCR擴增，得到擴增產物；

(4)以步驟(3)獲得的擴增產物為模板，利用步驟(2)篩選得到的內引物對進行熒光定量PCR，檢測熒光信號，根據SYBR GreenI通道下的循環閾值(Ct值)判斷待測樣品的外源靶基因是否存在。

其中，外源基因是指轉基因作物轉入或欲轉入的外源目的基因，所述方法能夠驗證轉基因作物是否已經含有外源目的基因。

所述內源基因可根據本領域常規選擇進行，例如，玉米可選擇內源基因IVR，油菜可選擇內源基因PEP，棉花可選擇內源基因Sad1，大豆可選擇內源基因Lectin，水稻可選擇內源基因SPS。

所述的轉基因品系旁臨序列是指外源基因插入基因組的位點的兩端的序列，引物在插入位點兩端設計，可以用于檢測轉基因品系類型。

引物設計出了上述要求外，調整所有內外引物Tm值基本一致以保證在同一退火溫度下均能順利擴增，并要將外引物產物大小控制在100-200bp左右，內引物產物大小控制在50-100bp左右。

為了實現高通量檢測，所述待測樣品的外源基因數量可為多個，待測樣品數量可為多個。同時增加了引物設計的要求和難度。

進一步地，所述步驟(4)中，需將針對不同基因的內引物對置于不同的PCR反應孔中，相互獨立地進行熒光定量PCR反應。