[發明專利]一種高通量的多重富集定量PCR(ME-qPCR)檢測轉基因作物元件及品系的方法

有效

• 申請號: 201610237272.2
• 申請日: 2016-04-15
• 公開（公告）號: CN105779611B
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發明（設計）人: 付偉;吳希陽;魏霜;劉津;朱鵬宇;王晨光;林春貴;朱水芳
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.用于檢測轉基因作物的引物組合在檢測轉基因作物中的應用，其特征在于，包括如下步驟：

（1）提取待檢樣品的DNA；

（2）第一輪多重富集PCR：以待測樣品DNA作為模板，利用用于檢測轉基因作物的引物組合進行多重富集PCR擴增，得到擴增產物；

（3）第二輪熒光定量PCR：將所述引物組合中針對不同基因的內引物置于不同的PCR反應孔中，均以步驟（2）獲得的擴增產物稀釋物為模板進行熒光定量PCR，檢測熒光信號，根據SYBR Green I通道下的循環閾值Ct值判斷待測樣品的外源靶基因；

其中，所述用于檢測轉基因作物的引物組合，包括如下引物序列：

玉米內源基因IVR內、外引物：

IVR的外引物的上游引物：5′- CACTCCATCGTGGAGAGCTT -3′；

IVR的外引物的下游引物：5′- GGCGTTGTTGAAGAGGAAGA -3′；

IVR的內引物的上游引物：5′- CTTTGCTCAAGGCGGGAGGA -3′；

IVR的內引物的下游引物：5′- GGAGTCGTAGATGGCTCGTGTG -3′；

油菜內源基因PEP內、外引物：

PEP的外引物的上游引物：5′- CAGTTCTTGGAGCCGCTTGAG -3′；

PEP的外引物的下游引物：5′- TGACGGATGTCGAGCTTCACA -3′；

PEP的內引物的上游引物：5′- AGACAGACCTACAGCCGATGGAA -3′；

PEP的內引物的下游引物：5′- AAGGGCCAGTCCAAATGCAGA -3′；

大豆內源基因Lectin內、外引物：

Lectin的外引物的上游引物：5′- AGTCGTCGCTGTTGAGTTTGA -3′；

Lectin的外引物的下游引物：5′- ACCCACTCGGGAAGAGAAGTC -3′；

Lectin的內引物的上游引物：5′- TGCCTCCACCAGCCTCTT -3′；

Lectin的內引物的下游引物：5′- AGTCTTCAAATCGACCACATCG -3′；

棉花內源基因Sad1內、外引物：

Sad1的外引物的上游引物：5′- CCAAAGGAGGTGCCTGTTCA -3′；

Sad1的外引物的下游引物：5′- TTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC -3′；

Sad1的內引物的上游引物：5′- TGCCTGTTCAGATCACCCACT -3′；

Sad1的內引物的下游引物：5′- GCCCAGCCCTCCAAAGATTTA -3′；

水稻內源基因SPS內、外引物：

SPS的外引物的上游引物：5′- TCCAGAGAGCCCCGAACTC -3′；

SPS的外引物的下游引物：5′- AGGAGAAGCACTGGACGAGG -3′；

SPS的內引物的上游引物：5′- AGCCCCGAACTCCTCCAAA -3′；

SPS的內引物的下游引物：5′- GGACGAGGAGAGAGAGGATGAG -3′；

轉基因玉米NK603品系特異性內、外引物：

NK603的外引物的上游引物：5′- CGGCCAGCAAGCCTTGTAG-3′；

NK603的外引物的下游引物：5′- TTTGGACTATCCCGACTCTCTTC -3′；

NK603的內引物的上游引物：5′- CGGCCAGCAAGCCTTGTAG -3′；

NK603的內引物的下游引物：5′- TCAAGCATATGAATGACCTCGA -3′；

轉基因玉米BT11品系特異性內、外引物：

BT11的外引物的上游引物：5′- CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT -3′；

BT11的外引物的下游引物：5′- GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT -3′；

BT11的內引物的上游引物：5′- CCTTCTTGGCGGCTTATCT -3′；

BT11的內引物的下游引物：5′- CATGTCGAGATCCGAGGGA -3′；

轉基因玉米MON810品系特異性內、外引物：

MON810的外引物的上游引物：5′- AACGTGCCCGGTACTGGTTC -3′；

MON810的外引物的下游引物：5′- GACTGCTCGCAAGCAAATTC -3′；

MON810的內引物的上游引物：5′- CCACAGCCACCACTTCTCC -3′；

MON810的內引物的下游引物：5′- GCAAGCAAATTCGGAAATGAA -3′；

轉基因玉米MON88017品系特異性內、外引物：

MON88017的外引物的上游引物：5′-AGCAGCAGAATCGTGTGACAAC -3′；

MON88017的外引物的下游引物：5′- TTTCCCGGACATGAAGCCAT -3′；

MON88017的內引物的上游引物：5′- CACATCATCGACAAGCACCTT -3′；

MON88017的內引物的下游引物：5′- CGGACATGAAGCCATTTACAAT -3′；

轉基因玉米T25品系特異性內、外引物：

T25的外引物的上游引物：5′- ACAAGCGTGTCGTGCTCCAC -3′；

T25的外引物的下游引物：5′- GACATGATACTCCTTCCACCG -3′；

T25的內引物的上游引物：5′- ATTGCCCTTTGGTCTTCTGA -3′；

T25的內引物的下游引物：5′- CAATGGCGGAACGACTCAA -3′；

轉基因玉米TC1507品系特異性內、外引物：

TC1507的外引物的上游引物：5′- TTGACAGGTTTGAGTTGATTCCAG -3′；

TC1507的外引物的下游引物：5′- CCAAGAACTCATGTTAGTCGCAA -3′；

TC1507的內引物的上游引物：5′- AGTTGATTCCAGTTACTGCCACA -3′；

TC1507的內引物的下游引物：5′- CATGTTAGTCGCAACGAAACC -3′；

轉基因大豆305423品系特異性內、外引物：

305423的外引物的上游引物：5′-CGTCAGGAATAAAGGAAGTACAGTA -3′；

305423的外引物的下游引物：5′- CAACCAAATGCCCTAAAGGATGCGT -3′；

305423的內引物的上游引物：5′- GTTGATTCCAGTTACTGCCACA -3′；

305423的內引物的下游引物：5′- CATGTTAGTCGCAACGAAACC -3′；

轉基因大豆FG72品系特異性內、外引物：

FG72的外引物的上游引物：5′- AGATTTGATCGGGCTGCAGG -3′；

FG72的外引物的下游引物：5′- GCACGTATTGATGACCGCATTA -3′；

FG72的內引物的上游引物：5′- AGATTTGATCGGGCTGCAGG -3′；

FG72的內引物的下游引物：5′- GCACGTATTGATGACCGCATTA -3′；

轉基因大豆A2704-12品系特異性內、外引物：

A2704-12的外引物的上游引物：5′- GGGCGTTCGTAGTGACTGAG -3′；

A2704-12的外引物的下游引物：5′- GCGTTACCCAACTTAATCGC -3′；

A2704-12的內引物的上游引物：5′- GGGGTCAAAGACCAAGAAGTG -3′；

A2704-12的內引物的下游引物：5′- GCTGGCGTAATAGCGAAGAG -3′；

轉基因油菜RT73品系特異性內、外引物：

RT73的外引物的上游引物：5′- CCATATTGACCATCATACTCATTGCT -3′；

RT73的外引物的下游引物：5′- GCTTATACGAAGGCAAGAAAAGGA -3′；

RT73的內引物的上游引物：5′- TAGATTTCCCGGACATGAAGA -3′；

RT73的內引物的下游引物：5′- AGGAAGGAAAGGCAAGGAAA -3′；

轉基因棉花GHB119品系特異性內、外引物：

GHB119的外引物的上游引物：5′-CCAGTACTAAAATCCAGATCATGCA -3′；

GHB119的外引物的下游引物：5′- GAAATTGCGTGACTCAAATTCC -3′；

GHB119的內引物的上游引物：5′-CCAGTACTAAAATCCAGATCATGCA -3′；

GHB119的內引物的下游引物：5′- GAAATTGCGTGACTCAAATTCC -3′；

轉基因水稻BT63品系特異性內、外引物：

BT63的外引物的上游引物：5′- CGGCCATTGATTTGTAGAGA -3′；

BT63的外引物的下游引物：5′- ATATGTTCGTAGCCCCACCACTA -3′；

BT63的內引物的上游引物：5′- CGGCCATTGATTTGTAGAGA -3′；

BT63的內引物的下游引物：5′- AGCCCCACCACTACTGCTTAT -3′；

Cry1Ab基因內、外引物：

Cry1Ab的外引物的上游引物：5′- GGACAACAACCCMAACATCAAC -3′；

Cry1Ab的外引物的下游引物：5′- GCACGAACTCGCTCAGCAG -3′；

Cry1Ab的內引物的上游引物：5′- CAACGAGTGCATCCCCTACAAC -3′；

Cry1Ab的內引物的下游引物：5′- GCTGATGTCGATGGGGGTGT -3′；

PAT基因內、外引物：

pat的外引物的上游引物：5′- AAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGT -3′；

pat的外引物的下游引物：5′- GATGCCTATGTGACACGTAAACAGTAC -3′；

pat的內引物的上游引物：5′- GTTGCTGAGGTTGAGGGTGTT -3′；

pat的內引物的下游引物：5′- TGTCCAATCGTAAGCGTTCCTA -3′；

GOX基因內、外引物：

Gox的外引物的上游引物：5′- GTCTTCGTGTTGCTGGAACCGTT -3′；

Gox的外引物的下游引物：5′- GAACTGGCAGGAGCGAGAGCT -3′；

Gox的內引物的上游引物：5′- ACCGTTGAGTTCGCTGGTC -3′；

Gox的內引物的下游引物：5′- AGAACGTGAGCACCCTTCC -3′；

EPSPS基因內、外引物：

EPSPS的外引物的上游引物：5′- GTTGCGGCCCTGCTTGT -3′；

EPSPS的外引物的下游引物：5′- CAGCGTGGAGGAGCGAAC -3′；

EPSPS的內引物的上游引物：5′- CCGACATCGAAGTCATCAACC -3′；

EPSPS的內引物的下游引物：5′- CAGCGTGGAGGAGCGAAC -3′；

CaMV35S基因內、外引物：

CaMV35S的外引物的上游引物：5′-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3′；

CaMV35S的外引物的下游引物：5′-CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3′；

CaMV35S的內引物的上游引物：5′- TCTCCACTGACGTAAGGGATGA -3′；

CaMV35S的內引物的下游引物：5′- GAAGGGTCTTGCGAAGGATAG -3′；

NOS基因內、外引物：

NOS的外引物的上游引物：5′- TGCCGGTCTTGCGATGA -3′；

NOS的外引物的下游引物：5′- AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC -3′；

NOS的內引物的上游引物：5′- TGCCGGTCTTGCGATGA -3′；

NOS的內引物的下游引物：5′- CCCATCTCATAAATAACGTCATGC -3′；

FMV35S基因內、外引物：

FMV35S的外引物的上游引物：5′-CTAGTACAAGTGGGGAACAAAATAACG-3′；

FMV35S的外引物的下游引物：5′-ATCTGATGATCCTTCAAATGGGAATGA-3′；

FMV35S的內引物的上游引物：5′- TCCTGACAGCCCACTCACTAA -3′；

FMV35S的內引物的下游引物：5′- AGGGAATTCTTTTGTGGTCGT -3′；

NPTII基因內、外引物：

NPTII的外引物的上游引物：5′- GGAAGGGACTGGCTGCTATTG -3′；

NPTII的外引物的下游引物：5′- GATGTTTCGCTTGGTGGTCG -3′；

NPTII的內引物的上游引物：5′- CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA -3′；

NPTII的內引物的下游引物：5′- GGTAGCCGGATCAAGCGTATG -3′；

bar基因內、外引物：

Bar的外引物的上游引物：5′- GCAACGCCTACGACTGGAC -3′；

Bar的外引物的下游引物：5′- TGACAGCGACCACGCTCTT -3′；

Bar的內引物的上游引物：5′- TCGACCGTGTACGTCTCCC -3′；

Bar的內引物的下游引物：5′- CTGTGCCTCCAGGGACTTCA -3′；

步驟（3）中的PCR反應體系為25μL：SYBR? Premix DimerEraser反應液12.5μL，引物終濃度各為0.4μmol/L，模板1μL，用ddH₂O補足； PCR反應條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃30 s，72℃ 30 s，40個循環。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，步驟（3）中，將步驟（2）獲得的擴增產物用ddH₂O稀釋100倍后作為模板。