[發明專利]一種超敏免疫檢測方法

在審

• 申請號: 201610235683.8
• 申請日: 2016-04-15
• 公開（公告）號: CN105779609A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 上海伊麗薩生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于免疫學領域，具體涉及一種超敏免疫檢測方法。

背景技術

酶聯免疫吸附測定(ELISA)是在免疫酶技術基礎上發展起來的一種免疫測定技 術，指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結合專一性進 行免疫反應的定性和定量檢測方法。該技術可用于檢測大分子抗原和特異性抗體等，具有 快速、簡便等優點。鑒于ELISA技術不夠靈敏，研究人員開發了結合ELISA的特異性和PCR的 信號放大功能的ELISA/Immuno-PCR平臺。操作方面，傳統ELISA的檢測抗體上間接或直接偶 聯的是酶(堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶)，加底物顯色作為讀板信號。而ELISA/Immuno- PCR方法是ELISA步驟在先，因檢測抗體上偶聯的是DNA模板，用DNA模板作定量PCR(QPCR)作 為顯示信號，這種方法與傳統ELISA相比，靈敏度提高了10～100倍，而且大大降低了樣品的 用量(10～100μL/孔降至0.1～1μL/孔)和介質效應(尤其是血清、血漿的介質效應)。

ELISA/Immuno-PCR的原理看似簡單，但把抗體與DNA放在一塊也引起了一些不便： ELISA的封閉液和洗液主要是針對抗體或蛋白的，而PCR系統需要去除抗體帶來的干擾；PCR 多個數量級的放大效應也會把非特異性信號放大導致本底過高。因此，研發人員需要對每 一步操作和試劑進行細致的優化，從而在使用上設置了比ELISA高的門檻。以嚴謹和精細著 稱的德國公司Chimera首先將這門技術推向了市場，其研發主要在于封閉液、洗液方面。 Chimera推出了商標為imperacer的檢測試劑，物美卻不價廉，其96孔板試劑盒價格在1200 美元左右(進口到國內會更貴)。同時，為了降低本底，他們的配套洗板機只能優化到8個針 而不是96或192個針，這就使得洗板時間大大延長了。另外，PCR步驟在96孔的ELISA板上進 行，使得樣品的檢測通量少于每板40個。基于此，Chimera的ELISA/Immuno-PCR步驟通常耗 時一天，且最多只能測1到2個96孔板(少于80個樣品)。另據文獻報道，在ELISA板上直接進 行定量PCR，靈敏度要比用純化的DNA模板在空白板上進行定量PCR低很多。

綜上所述，現有技術存在的技術問題主要在于：(1)封閉液和洗液體系太貴，洗板 機速度效率低；(2)不能快速干凈的從檢測抗體上分離模板DNA，導致定量PCR的靈敏度和整 個Immuno-PCR的靈敏度不能最大化；(3)檢測通量低，每天每人每套機器少于80個樣品的檢 測通量是不能降低成本的，也不可能滿足大中型醫院病人和藥物公司藥物篩選的需求。因 此，如何從偶聯抗體上分離DNA模板，同時提高檢測樣品的通量，提高靈敏度，降低成本，就 成了目前亟待解決的問題。

發明內容

針對以上問題，本發明提供一種高通量、低成本的超敏免疫檢測方法，可用于生物 醫學指標的超敏檢測，還可用于以監測生物標志物濃度為基礎的新藥篩選平臺的建立。

為解決以上技術問題，本發明通過以下技術方案實現：

設計一種超敏免疫檢測方法，包括以下步驟：

(1)制備DNA偶聯的檢測抗體：設計DNA模板，并進行生物素化；合成光裂解基團，并 連接至DNA模板一端，再將所得模板DNA的光裂解基團一端偶聯到檢測抗體上；根據所述DNA 模板設計定量PCR引物及熒光探針；

所述光裂解基團為生物素胞嘧啶雙賴氨酸二肽，如式I所示。

(2)ELISA步驟：依次進行包被、封閉之后，先對待測樣品進行對溫育，再加入所得 DNA偶聯的檢測抗體，進行溫育；

本步驟洗板過程所用洗液優選為含0.1wt％Tween-20的PBS緩沖液。封閉過程所用 封閉液包括10wt％rabbitIgG、0.035wt％Brij、20mmol/LTris、150mmol/LNaCl，其pH為 7.5。

(3)定量PCR：用光(優選波長300～350nm)照射板孔使DNA模板與檢測抗體斷裂脫 離，加入DNA-抗體分離液；混勻后轉至定量PCR板，加入PCR混合物，進行PCR擴增，對擴增產 物進行歸納分析，即可。

本步驟所用DNA-抗體分離液包括100mmol/LCAPSO、1mol/LNaCl，其pH為10.0。

本發明的積極有益效果在于：