[發明專利]基于輕同位素近同重標記的整體蛋白質定量分析方法

有效

• 申請號: 201610235638.2
• 申請日: 2016-04-15
• 公開（公告）號: CN105785048B
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發明（設計）人: 田志新
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司31225
• 代理人: 褚明偉

技術領域

本發明涉及一種蛋白質或多肽的定量分析方法，尤其是涉及一種基于輕同位素近同重標記的整體蛋白質定量分析方法。

背景技術

近兩三年來，商業化的高質量分辨、高質量測量精度質譜儀有了飛躍式發展，也就是軌道阱質譜儀的出現。軌道阱質譜儀跟傅里葉變換離子回旋共振質譜儀分辨率和精度相當；但價格相對便宜，質譜采集速度更快、解離效率更高。該質譜儀的相對普及為分子量相對較大的整體蛋白的質譜及串級質譜分析提供了堅實的基礎。在整體蛋白定量標記方面，基于SILAC的體內標記和基于TMT的體外標記，由于靶向氨基酸的非完全標記(如重的賴氨酸或精氨酸在SILAC中的非完全替代)和非靶向氨基酸的非選擇性標記(如蘇氨酸的TMT標記)，其應用范圍受到了比較大的限制。二甲基(同位素，isotopic或同重，isobaric)標記由于其試劑易得，標記效率高，在多肽定量方面已得到了廣泛的研究和應用；我國科學家在這個定量技術方面也做出了巨大的貢獻，發展了多種不同形式的二甲基標記；其中中國科學院大連化學物理研究所張玉奎院士和張麗華研究員課題組發展的N端同重二甲基標記和復旦大學楊芃原教授和陸豪杰教授課題組發展的賴氨酸殘基上的氨基的胍化保護組合起來可直接應用于蛋白的定量標記，有較好的前景。

然而，上述同重二甲基標記中所使用的重同位素(¹³C和D)試劑都非常昂貴，如1mL 20％¹³C甲醛(H¹³CHO)的價格為4350元(Cambridge Isotope Lab，產品代碼CLM-806-PK)，1g氘代氰基硼氫化鈉的價格為2377.25元(Sigma，產品代碼190020-1G)。因此，新型高效但廉價的試劑有著廣闊的前景和市場。

申請人前期在整體蛋白質定性定量分析方面已經做了較多的工作，有較好的基礎。

在定量數據挖掘方面，公布號為CN103389335A的中國專利公布了一種鑒定生物大分子的分析裝置和方法。公布號為CN 104765984A的中國專利公布了一種生物質譜數據庫快速建立與搜索的方法。公布號為CN104359967A的中國專利公布了一種生物質譜重疊同位素輪廓的解析方法。上述專利中公布了同位素輪廓指紋比對算法(isotopic envelope fingerprinting，iEF)，直接在原始數據上進行匹配離子的搜索和蛋白質的鑒定。該算法無需對實驗數據進行“去同位素”預處理，可以節省相應的時間；根據各個離子中是否有同位素峰缺失和同位素峰相對強度的偏差對理想及非理想實驗數據進行很好的區分，保證蛋白鑒定的可信度；根據已知重疊離子的同位素峰相對強度關系對重疊實驗數據進行有效的解析。基于該算法申請人成功地開發了整體蛋白數據庫搜索引擎ProteinGoggle，在單個標準蛋白(泛素、肌紅蛋白)及整體蛋白質組混合物(組蛋白H4家族翻譯后修飾異構體、大腸桿菌)的定性鑒定中，表現出較高的可信度和較好的應用前景。在定量分析方面，ProteinGoggle有著它內在的和獨特的潛在優勢；一方面基于同位素輪廓及其中每個同位素的指紋比對可以快速精確地搜索同位素或同重標記的定量離子對；另一方面，搜索過程中每個離子中每個同位素峰的實驗強度都被記錄和輸出，可以用來直接計算相對定量比。

在定量標記方面，公布號為CN105137088A的中國專利公布了一種整體蛋白質定量分析方法。公布號為CN105242050A的中國專利公布了一種不同生理或病理條件下整體蛋白質的定量分析方法，該專利對N端氨基進行同重標記，分別標記為-N(CH₂D)₂和-N(¹³CH₃)₂。上述兩份專利均是基于重同位素的定量標記方法。由于采用重同位素(¹³C和D)，因此其費用仍然很高。

發明內容

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種基于輕同位素近同重標記的整體蛋白質定量分析方法。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

一種基于輕同位素近同重標記的整體蛋白質定量分析方法，包括以下步驟：