[發明專利]實時熒光定量PCR鑒別蘄蛇的方法

在審

• 申請號: 201610235100.1
• 申請日: 2016-04-15
• 公開（公告）號: CN105695611A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 陳學松;黃林杰;羅達龍;黃琳
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區梧州食品藥品檢驗所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市越秀區海心聯合專利代理事務所(普通合伙) 44295
• 代理人: 黃為;蔡國

技術領域

本發明提供一種鑒別蘄蛇的方法，具體的說是實時熒光定量 PCR鑒別蘄蛇的方法；屬于化學檢測技術領域。

背景技術

蘄蛇為為蝰科類動物五步蛇的干燥體,具有祛風、通絡、止痙 的功效。由于其藥用價值較高，導致近年來被大量捕捉，藥材資源 不斷減少，大量偽品充斥著市場，質量問題日益嚴重。傳統的蘄蛇 藥材的鑒別，主要是對其頭部、鱗片和骨骼的形態特征進行性狀鑒 別，這對實驗人員的中藥材鑒別經驗及蘄蛇藥材的完整性要求較 高。隨著分子生物學的發展，使得中藥材的分子遺傳標記鑒別成為 可能。

一直以來，蘄蛇的傳統鑒別方法為形態學鑒別,由于市場上的蘄 蛇特別是經過炮制后的產品，多除去了頭、鱗、骨，外觀形態上已 經發生了很大的改變，這對藥材的鑒別帶來了較大的困難。文獻上 已經引入了PCR方法來鑒別蘄蛇，對于不能通過性狀、顯微來鑒別 真偽的，只需要有特定的引物和相關試劑，經過模板DNA提取、 PCR反應和電泳檢測3個步驟即可完成鑒別。但是，相比較qPCR 而言，普通PCR法使用的儀器較多，需要PCR儀、電泳儀、凝膠 成像儀或紫外透射儀等，且時間不少于2小時。

發明內容

針對上述不足，本發明的目的是提供一種具有操作簡單、時間 短、準確率高，不易造成污染的實時熒光定量PCR鑒別蘄蛇的方 法。

為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案如下：

一種實時熒光定量PCR鑒別蘄蛇的方法，依次包括下述步驟：

1)引物稀釋放-20℃保存備用；

2)樣品前處理取試樣中段的肌肉組織剪碎，加入研缽中研成粉 末，稱取30mg至2ml滅菌離心管中；

3)模板DNA提取前處理好的樣品，提取DNA,置-20℃保存備 用；

4)配置PCR反應液配

每次PCR實驗需要陰性對照、陽性對照各一個，共制備7管， 按照以上順序依次加入試劑至干凈的離心管中，渦旋振蕩混勻后， 放冰盒上待用；將滅菌的PCR八聯管固定在PCR管盒上，將冰盒 上的反應液離心后，打開蓋子，加至PCR管中，每管18μl；

5)加模板往上述PCR管中加入2μl提取好的DNA，加樣順序 為陰性對照、待檢樣品、陽性對照，敲打PCR管盒，使反應液與 DNA混勻，并經3000轉離心30秒，立即進行PCR反應；

6)熒光定量PCR測試

儀器參數：檢測模式為熒光通道，反應總體積為20μl， SYBRGreenI染色，依次選擇“預變性”和“二步擴增”，收集熒 光；PCR反應參數：95℃預變4min，然后進行45個循環：95℃變 性30s，63℃復性45s并采集熒光；

7)結果判定

陰性對照需無Cq值，曲線為直線或輕微斜線，無明顯指數增長 期；

陽性對照需Cq≤30，曲線有明顯指數擴增期；

無Cq值，曲線為直線或輕微斜線，無明顯指數增長期，可報告 樣品陰性；

2.7.4Cq值≤36，曲線有明顯指數擴增期，可直接報告樣品陽 性。

進一步的，上述的一種實時熒光定量PCR鑒別蘄蛇的方法，所 述的八聯管為0.2ml離心管。

進一步的，上述的一種實時熒光定量PCR鑒別蘄蛇的方法，其 特征在于，所述的試劑動物組織基因組DNA提取試劑盒購自廣州迪 奧生物科技有限公司，型號：DePureTissueDNAKit。

與現有技術相比，本發明提供的技術方案qPCR只需要一臺儀 器，就能完成整個試驗流程，實驗花費的時間減少一半，操作簡 單，樣品經過前處理，放入儀器1小時后即可進行分析，無須開蓋 轉移樣本，避免污染，且能每時每刻記錄樣本的熒光值變化。本研 究對3個蘄蛇正品和2個混偽品的鑒別準確率為100％，且經多次重 復測試，重現性好，說明該方法對鑒別蘄蛇的真偽是可行有效的。

附圖說明

圖1是蘄蛇陽性品擴增曲線圖。

圖2是蘄蛇陰性品擴增曲線圖。

具體實施方式

下面結合具體實施方式，對本發明的權利要求做進一步的詳細 說明，但不構成對本發明的任何限制，任何在本發明權利要求保護 范圍所做的有限次的修改，仍在本發明的權利要求保護范圍之內。

實施例1

1.材料與儀器

1.1材料