[發明專利]一種海南黃花梨和越南黃花梨的分子鑒定方法和鑒定引物

有效

• 申請號: 201610231958.0
• 申請日: 2016-04-12
• 公開（公告）號: CN105695610B
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 涂鐵要;李世晉;李永泉;朱成杰;李顯強;劉俊芳;張奠湘
• 申請（專利權）人: 中國科學院華南植物園;廣東省林業科技推廣總站
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司44001
• 代理人: 劉明星

技術領域

本發明屬于分子標記技術領域，具體涉及一種海南黃花梨和越南黃花梨的分子鑒定方法和鑒定引物。

背景技術

海南黃花梨，又名降香黃檀(Dalbergia ordorifera T.Chen)是豆科黃檀屬(Dalbergia L.)植物，為高大喬木，特產我國海南，是眾所周知的最為名貴的紅木種類，目前市場上每公斤海南黃花梨木材的銷售價格已經超過1萬元人民幣。海南黃花梨高昂的市場價格所造成的巨大利益驅動，導致市場上大量出現走私售假的不法行為。我們通過走訪紅木市場和商家企業發現，目前市場上超過90％的海南黃花梨均產于越南、價格不到海南黃花梨一半的越南黃花梨(又名越南黃檀Dalbergia tonkinensis Prain)走私到我國并冒充海南黃花梨。假冒現象如此普遍的原因則在于，傳統的木材解剖等鑒定手段原則上只能鑒定到大類，不可能鑒定到具體的物種。例如，對于一個樣品，利用傳統的木材鑒定方法，可將其鑒定為黃檀類或香枝木類木材，而不可能準確鑒定為海南黃花梨或越南黃花梨。

生物的DNA含有大量的遺傳密碼信息，這些遺傳密碼信息可以用于物種之間甚至同一個物種不同個體之間的鑒定，廣為人知的人類親子鑒定便是其中一例。對于木材的鑒定，傳統的木材鑒定方法，包括木材解剖、物理和化學指標檢測，都只能鑒定到大類，即屬于某一類型的木材，而不可能準確鑒定到具體的原生樹種。相比而言，針對性地開發特殊的植物質體DNA測序引物，測得目標物種特異的DNA序列，通過和標準樣品進行DNA比對，能夠更準確地進行木材樣品的原生樹種鑒定。這是因為(1)質體DNA為植物所特有，在進行DNA序列測序和比對分析的時候方便排除木材中附帶的木材內生真菌DNA的影響；(2)質體DNA在植物中的含量遠遠高于核DNA，對一些保存狀況不甚理想的木材樣品，也方便獲得足夠的DNA進行樣品分析；(3)植物質體DNA為環狀結構，其中的每個基因僅有一個拷貝，避免了核基因多個拷貝的存在而產生的假陽性現象。

因此，如能開發一種利用海南黃花梨與越南黃花梨質體DNA序列的差異而對二者進行準確鑒定方法將能彌補傳統鑒定方法的不足，提供一種有效的鑒定手段。

發明內容

本發明的目的是針對傳統木材鑒定方法不能準確鑒定區分海南黃花梨和越南黃花梨的不足，提供一種基于質體基因rpoC2和petD序列差異的海南黃花梨和越南黃花梨的分子鑒定方法和鑒定引物。

本發明的海南黃花梨和越南黃花梨的分子鑒定方法，包括以下步驟：

a、對待鑒定樣品進行總DNA提取；

b、PCR擴增：以步驟a提取的總DNA為模板，分別用rpoC2序列的正/反向引物和petD序列的正/反向引物進行PCR擴增，分別得到擴增產物；所述的rpoC2序列的正向引物的堿基序列如SEQ ID NO.5所示，所述的rpoC2序列的反向引物的堿基序列如SEQ ID NO.6所示，所述的petD序列的正向引物的堿基序列如SEQ ID NO.7所示，所述的petD序列的反向引物的堿基序列如SEQ ID NO.8所示；

c、序列比對：將擴增產物測序，然后將測序的rpoC2序列與SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3進行比對，將測序的petD序列與SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4進行比對；如果rpoC2序列與SEQ ID NO.1一致、petD序列與SEQ ID NO.2一致，則該待鑒定樣品為海南黃花梨；如果rpoC2序列與SEQ ID NO.3一致、petD序列與SEQ ID NO.4一致，則該待鑒定樣品為越南黃花梨。

優選，所述的步驟a的對待鑒定樣品進行總DNA提取后，還用PEG試劑對總DNA進行純化并使DNA終濃度為50-200ng/μl。

優選，所述的步驟b的PCR擴增的反應體系為：含有Buffer(Mg²⁺plus)5μl、dNTP Mixture(2.5mM)2μl、正向引物(10μM)0.5μl、反向引物(10μM)0.5μl、總DNA模板1μl和HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.25μl，其余由滅菌蒸餾水補足至25μl；反應條件為：95℃3min；94℃30s，50-52℃30s，72℃1min，35個循環；72℃10min。