[發明專利]制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法

在審

• 申請號: 201610230431.6
• 申請日: 2016-04-14
• 公開（公告）號: CN107224446A
• 公開（公告）日: 2017-10-03
• 發明（設計）人: 莊明熙;彭秋瑩;鐘心語;紀正祐;劉曲婷;郭蕙甄
• 申請（專利權）人: 超微體生醫科技股份有限公司
• 主分類號: A61K36/07
• 分類號: A61K36/07;A61P35/00
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司11100
• 代理人: 張晶,郭佩蘭

技術領域

本發明與皿培式牛樟芝(Antrodia cinnamomea)中活性成分有關，更詳而言之是指一種制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法者。

背景技術

牛樟芝子實體所含的多種化合物、三萜類活性成分，已被不少研究證實具有抗腫瘤、抑制癌細胞生長的功效，如刊登在“活體外毒理學(Toxicology in Vitro)”期刊的馬偕一號(MMH01)(“去氫硫色多孔菌酸化合物(dehydrosulphurenic acid)”)，及登載在“國際老人醫學期刊(International Journal of Gerontology)”的馬偕二號(MMH02)(羊毛甾烷(Lanostane)三萜類成分)等，而已知生產牛樟芝的技術中，利用皿培方式生產牛樟芝，不僅生長速度快，且萃取物的抗癌效果更得到提升，并可減少牛樟樹被砍伐、加強民眾的環保意識。

已知關于牛樟芝抗癌成分、化合物制備的專利甚多，例如，中國專利CN 102232944B、CN 102000047B、CN 102232945B、CN 102232940B、CN 102232943B、CN 102232942B、CN 102232941B、CN 102443613、CN 104177240A，及美國專利US8546366等，已揭露牛樟芝萃取物中的化合物可抑制癌細胞生長。

其次，已知自牛樟芝中萃取三萜類化合物成分的專利亦不少，例如，中國專利CN 102614195A與美國公開第2010/0210869A1號公開案，以乙醇溶液、正己烷溶液或乙酸乙酯溶液，依次對牛樟芝子實體進行麥角甾醇(Ergosterol)與羊毛甾醇(Lanosterol)三萜類成分的萃取。美國專利US7994158B2以水或有機溶劑(如醋酸、乙酸乙酯、苯、醇類、二氯甲烷等)對牛樟芝進行萃取，得到的水或有機溶劑萃取物，再經硅膠、Sephadex吸收、濃縮和純化。中國發明公開CN 101555436與中華民國發明第I487531號專利，利用溶劑(乙醇)混合于超臨界CO₂，再通入置放有固態牛樟芝的萃取槽中進行萃取，不是萃取過程沒有達成穩定狀態，牛樟芝的機能成分會不穩定地被萃取出來，即是采固液分離且批式的萃取方式，無法純化其機能成分、生產成本高。

由上可知，已知牛樟芝三萜類活性成分的萃取方法，大多是利用有機溶劑萃取后再進行濃縮、分離與純化，制作過程冗長繁復，且有機溶劑易殘留，造成毒害與安全性疑慮，而已知超臨界流體萃取是將溶劑與CO₂直接混合后進入 進行萃取，需要大量的測試及工作經驗，且需經過純化步驟。

發明內容

本發明的主要目的即在提供一種制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法，其在超臨界狀態下，以最少量的乙醇溶劑與超臨界二氧化碳流體即可達到平衡，并有最大的分離效果，可達到萃取與分離出三萜類化合物活性成分的功效，且通過多種細胞檢測技術，證實所制備的三萜類化合物活性成分確實具有抗癌效果，實為安全、環保與節能的有效方式。

于是，為達成前述的目的，本發明提供一種制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法，其步驟至少包含有：備取牛樟芝：將1-2Kg的皿培式牛樟芝放置于一萃取槽內；萃取與分離：在操作壓力2000-4000psi、溫度40-60℃的操作條件下，將超臨界狀態溶劑以3-9L/hr流速通入該萃取槽進行萃取，超臨界狀態溶劑為超臨界CO₂流體與乙醇以1：0.1-0.2(v/v)的體積比例混合至飽和狀態，萃取30-60分鐘后，將牛樟芝萃取物通入一層析管柱，利用該層析管柱將牛樟芝萃取物分離出雜質與三萜類化合物，雜質可自該層析管柱的底部去除，另自該層析管柱的頂部取出高濃度三萜類化合物；檢測：通過細胞毒性試驗、細胞形態變化分析、細胞周期、細胞凋亡檢測及細胞爬行轉移分析，檢測三萜類化合物的抗癌效果。

更進一步地，檢測的步驟中，細胞毒性試驗的方式，為將大腸癌細胞株放置于一96孔培養盤(10,000cells/well)內200μL的完全培養基(McCoy’s 5a)中，預定時間后將培養基置換成含三萜類化合物0.25-1.0mg/mL的完全培養基，并加入到96孔培養盤的不同孔中；另外，對照組則只加入200μL的完全培養基，培養預定時間后，以四甲基偶氮唑鹽(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)