[發(fā)明專利]制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610230431.6
• 申請日: 2016-04-14
• 公開（公告）號: CN107224446A
• 公開（公告）日: 2017-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 莊明熙;彭秋瑩;鐘心語;紀(jì)正祐;劉曲婷;郭蕙甄
• 申請（專利權(quán)）人: 超微體生醫(yī)科技股份有限公司
• 主分類號: A61K36/07
• 分類號: A61K36/07;A61P35/00
• 代理公司: 北京北新智誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11100
• 代理人: 張晶,郭佩蘭

1.一種制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法，其特征在于，步驟至少包含有：

備取牛樟芝：將1-2Kg的皿培式牛樟芝放置于一萃取槽內(nèi)；

萃取與分離：在操作壓力2000-4000psi、溫度40-60℃的操作條件下，將超臨界狀態(tài)溶劑以3-9L/hr流速通入該萃取槽進(jìn)行萃取，超臨界狀態(tài)溶劑為超臨界CO₂流體與乙醇以1：0.1-0.2(v/v)的體積比例混合至飽和狀態(tài)，萃取30-60分鐘后，將牛樟芝萃取物通入一層析管柱，利用該層析管柱將牛樟芝萃取物分離出雜質(zhì)與三萜類化合物，雜質(zhì)可自該層析管柱的底部去除，另自該層析管柱的頂部取出高濃度三萜類化合物；及

檢測：通過細(xì)胞毒性試驗(yàn)、細(xì)胞形態(tài)變化分析、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡檢測及細(xì)胞爬行轉(zhuǎn)移分析，檢測三萜類化合物的抗癌效果。

2.如權(quán)利要求1所述制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法，其特征在于，檢測的步驟中，細(xì)胞毒性試驗(yàn)的方式，為將大腸癌細(xì)胞株放置于一96孔培養(yǎng)盤內(nèi)200μL的完全培養(yǎng)基中，預(yù)定時(shí)間后將培養(yǎng)基置換成含三萜類化合物0.25-1.0mg/mL的完全培養(yǎng)基，并加入到96孔培養(yǎng)盤的不同孔中；另外，對照組則只加入200μL的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)預(yù)定時(shí)間后，以四甲基偶氮唑鹽比色法分析測定每孔中的活細(xì)胞數(shù)量比值，并以免疫酵素分析儀在570nm下測定吸光值。

3.如權(quán)利要求2所述制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法，其特征在于，為1天后將培養(yǎng)基置換成含三萜類化合物的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天后以四甲基偶氮唑鹽比色法測定每孔中的活細(xì)胞數(shù)量比值。

4.如權(quán)利要求1所述制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法，其特征在于，檢測的步驟中，細(xì)胞形態(tài)變化分析的方式，為將大腸癌細(xì)胞株放置于一培養(yǎng)盤，預(yù)定時(shí)間待細(xì)胞貼底后，給予適量含有三萜類化合物1.0mg/mL的樣品，并置于培養(yǎng)盤中預(yù)定時(shí)間后，以倒立顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照記錄。

5.如權(quán)利要求4所述制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法，其特征在于，該培養(yǎng)盤為皮氏培養(yǎng)皿，等待細(xì)胞貼底時(shí)間為1天，而細(xì)胞貼底后給予含有三萜類化合物樣品并置于培養(yǎng)盤的時(shí)間為2、7、14、21、28天。

6.如權(quán)利要求1所述制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法，其特征在于，檢測的步驟中，細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測的方式，為將大腸癌細(xì) 胞株經(jīng)三萜類化合物1.0mg/mL處理后，以胰蛋白-乙二胺四乙酸處理細(xì)胞，與培養(yǎng)液一起收集，離心后去掉上清液，并以4℃磷酸鹽緩沖溶液清洗后，加入1mL冰冷的75％酒精，放入4℃冰箱預(yù)定時(shí)間以固定細(xì)胞。離心后，續(xù)以1mL磷酸鹽緩沖溶液懸浮，加入50mg/mL的碘化丙錠避光作用預(yù)定時(shí)間，以532nm波長激發(fā)后，在590±40nm波長偵測細(xì)胞熒光含量，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

7.如權(quán)利要求6所述制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法，其特征在于，所述避光作用為10分鐘。

8.如權(quán)利要求1所述制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法，其特征在于，檢測的步驟中，細(xì)胞爬行轉(zhuǎn)移分析的方式，為將大腸癌細(xì)胞株放置于一6孔培養(yǎng)盤(800,000cells/well)內(nèi)，培養(yǎng)于2mL的完全培養(yǎng)基，預(yù)定時(shí)間后，先用200μL滴管尖頭畫出一條直線，再將培養(yǎng)基置換成含三萜類化合物0.25-1.0mg/mL的完全培養(yǎng)基加到培養(yǎng)盤的不同孔中，并在100倍顯微鏡下拍照記錄Day0的直線寬度。另外，對照組則只置換成2mL的完全培養(yǎng)基、無其他添加物，將該培養(yǎng)盤靜置24小時(shí)，并拍照記錄Day 1直線寬度密合的程度，最后以一量測軟件測量每張圖上任意5點(diǎn)的寬度變化，每個(gè)條件可得至少25個(gè)測量數(shù)據(jù)，比較Day 0與Day 1的平均數(shù)據(jù)，即可計(jì)算出細(xì)胞爬行比率。

9.如權(quán)利要求8所述制備皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜類化合物的方法，其特征在于，將大腸癌細(xì)胞株培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基內(nèi)為1天，該量測軟件為Image J軟件。

10.一種抗癌成分三萜類化合物，為依據(jù)如權(quán)利要求1、2、4、6或8所述方法所制備。