[發(fā)明專利]一種紅鈴蟲抗性基因AQ65檢測引物組、試劑盒及使用方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610227705.6
• 申請日: 2016-04-13
• 公開（公告）號: CN105671193B
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發(fā)明（設計）人: 王玲;萬鵬;吳孔明;王金濤;叢勝波;許冬;黃民松
• 申請（專利權）人: 湖北省農(nóng)業(yè)科學院植保土肥研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 北京東方靈盾知識產(chǎn)權代理有限公司 11506
• 代理人: 鄭利華;熊劍

1.一種紅鈴蟲抗性基因AQ65檢測引物組，其特征在于包括下述引物：

上游引物AQ65F：TGGCTTCGGTAAAGACGCTAT，

下游引物AQ65R：TGGGATTACGGGCGTGAGT；

和

上游引物AQ65F2：5'CAATGGAAAGCACTGAAGGC 3'，

下游引物AQ65R2：5'GCTGGAGAAGAAATGGCAAGA 3'。

2.一種紅鈴蟲抗性基因AQ65檢測試劑盒，其特征在于包括：DNA提取液，PCR反應液，標準陽性模板，陰性質控標準品，權利要求1所述引物組。

3.根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述PCR反應液包括LATaq酶、10×LATaq緩沖液-Mg²⁺Plus、dNTPs和無菌雙蒸水。

4.權利要求2所述檢測試劑盒的使用方法，其特征在于包括下述步驟：

1)基因組DNA樣品制備；

2)PCR檢測；

其中所述試劑盒包括DNA提取液，標準陽性模板，陰性質控標準品，PCR反應液，權利要求1所述的引物組。

5.根據(jù)權利要求4所述的使用方法，其特征在于包括下述步驟：

1)基因組DNA樣品制備

樣品來源：田間采集到的紅鈴蟲個體，采用單頭提取的方法，即單頭紅鈴蟲提取的基因組DNA為一個檢測樣本，紅鈴蟲基因組DNA的提取使用天根公司Tiangen Biotech Co.,Ltd生產(chǎn)的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒-離心柱型，實驗操作具體步驟按照試劑盒說明書進行；

2)PCR檢測

以提取的基因組DNA為模板，用設計的引物進行PCR擴增，其擴增的參數(shù)如下：94℃預變性2min；然后為35個循環(huán)，循環(huán)條件為：94℃變性30s，接著55℃退火30s，再72℃延伸1min；最后72℃保溫10min，PCR反應體系為25μL，如下所示：

取出PCR反應所需試劑及保存的DNA樣品于冰上解凍，Taq酶應現(xiàn)用現(xiàn)取，且用完后需馬上放回-20℃保存，從而延緩酶活性的損失，反應液中各組分的比例如下：

PCR反應結束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，于凝膠成像儀拍攝電泳圖，根據(jù)特異引物擴增的目標條帶判斷是否含有AQ65品系的抗性等位基因。