[發明專利]一種丙烯醛?DNA加合物的測定方法

有效

• 申請號: 201610227445.2
• 申請日: 2016-04-13
• 公開（公告）號: CN105911168B
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 侯宏衛;胡清源;陳歡;劉魯娟;王紅娟;朱貝貝;陳建
• 申請（專利權）人: 國家煙草質量監督檢驗中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司41110
• 代理人: 姜振東

技術領域

本發明屬于DNA樣本的理化檢驗技術領域，主要涉及DNA中6-羥基-1,N²-丙醇-2'-鳥嘌呤（α-Acr-dG）和8-羥基-1,N²-丙醇-2'-鳥嘌呤（γ-Acr-dG）加合物的測定技術領域，具體說是一種采用液相色譜-電噴霧電離-串聯質譜儀（LC- MS/MS）測定DNA中丙烯醛-DNA加合物的方法。

背景技術

丙烯醛是一種廣泛存在于環境基質中的污染物。它們主要產生于有機物的不完全燃燒，如工業生產、卷煙煙氣、機動車尾氣和烹飪油煙等。活潑的醛基不需要經過機體代謝就能夠直接攻擊生物體內親核基團，如核酸中的鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶形成DNA加合物。丙烯醛形成的主要DNA加合物包括6-羥基-1,N²-丙醇-2'-鳥嘌呤（α-Acr-dG）和8-羥基-1,N²-丙醇-2'-鳥嘌呤（γ-Acr-dG）。這兩種DNA加合物均可引起G→ T突變。

目前，關于DNA加合物的分析檢測方法報道的較多，主要有³²P-后標記技術、酶聯免疫技術（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC-UV）和液相色譜-串聯質譜技術（LC-MS/MS）。其中LC-MS/MS由于其較高的靈敏度和選擇性被廣泛應用于DNA加合物的檢測分析。

發明內容

本發明的目的正是基于上述現有技術狀況而采用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）技術建立的丙烯醛-DNA加合物（α-Acr-dG和γ-Acr-dG）的測定方法。該方法具有快速、準確、靈敏度高等特點，可用于DNA中丙烯醛-DNA加合物的定性定量分析。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

一種丙烯醛-DNA加合物的測定方法，即DNA中α-Acr-dG和γ-Acr-dG的測定方法，具體步驟如下：

a、丙烯醛暴露小牛胸腺DNA：取400 μg小牛胸腺DNA，加入配制好的丙烯醛溶液（丙烯醛溶液用0.1 M的PBS溶液配制，濃度0.001-1 mM），對照組加入同等體積的PBS溶液。將上述溶液放入37℃恒溫培養箱中24 h；使用2倍體積的冰乙醇沉淀DNA并終止反應，離心去掉上清液，用70%的乙醇水溶液清洗DNA樣品，得到的DNA團塊晾干并加入200 μL超純水復溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度計在260nm處檢測DNA的含量，對于雙鏈DNA一個吸收單位相當于50 μg/mL。

b、DNA的酶水解及固相萃取（SPE）：將上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl₂緩沖液（pH=7）中，加入20 μL混合內標，加入60U脫氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，隨后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U堿性磷酸酶在37℃中繼續孵育2h。水解液經1 mL甲醇活化和1 mL 純水平衡的Strata-X固相萃取小柱，用1 mL超純水和1 mL 10%的甲醇水淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇水洗脫，收集洗脫液即為樣品待測液。此過程的目的是為了使雙鏈DNA酶解成單核苷酸狀態，通過固相萃取和氮吹濃縮純化分離并富集所需的DNA加合物。所述混合內標為100 ng/mL的 [¹⁵N₅]α-AcrdG 和[¹⁵N₅]γ-AcrdG。

c、標準工作液的配制：用甲醇配制不同濃度的α-Acr-dG和γ-Acr-dG標準工作溶液。

d、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）測定，吸取配制好的不同濃度混合標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統，得到線性回歸方程，對樣品待測液進行測定，測得分析物與內標峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。

色譜條件：選取Extend-C18（1.8 μm，4.6×100 mm）色譜柱，流動相體系選取A：0.01%甲酸甲醇和B：10 mM乙酸銨水溶液，洗脫條件為梯度洗脫：0-2 min：25% A，2-7 min：35% A，7-10 min：25% A；流速為0.38 mL/min。分析時間為10 min，進樣量為5 μL。