[發(fā)明專利]一種丙烯醛?DNA加合物的測定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610227445.2
• 申請日: 2016-04-13
• 公開（公告）號: CN105911168B
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 侯宏衛(wèi);胡清源;陳歡;劉魯娟;王紅娟;朱貝貝;陳建
• 申請（專利權(quán)）人: 國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司41110
• 代理人: 姜振東

1.一種丙烯醛-DNA加合物的測定方法，所述丙烯醛-DNA加合物是6-羥基-1,N²-丙醇-2'-鳥嘌呤（α-Acr-dG）和8-羥基-1,N²-丙醇-2'-鳥嘌呤（γ-Acr-dG），其特征在于：包括以下具體步驟：

a、丙烯醛暴露小牛胸腺DNA：取400 μg小牛胸腺DNA，加入配制好的丙烯醛溶液，對照組加入同等體積的PBS溶液；將上述溶液放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h；使用2倍體積的冰乙醇沉淀DNA并終止反應(yīng)，離心去掉上清液，用70%的乙醇水溶液清洗DNA樣品，得到的DNA團(tuán)塊晾干并加入200 μL超純水復(fù)溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度計在260nm處檢測DNA的含量，對于雙鏈DNA一個吸收單位（OD）相當(dāng)于50 μg/mL；

b、DNA的酶水解及固相萃取（SPE）：將上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl₂緩沖液中，加入20 μL混合內(nèi)標(biāo)，加入60U脫氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，隨后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U堿性磷酸酶在37℃中繼續(xù)孵育2h，水解液經(jīng)1 mL甲醇活化和1 mL 純水平衡的Strata-X固相萃取小柱，用1 mL超純水和1 mL 10%的甲醇水淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇水洗脫，收集洗脫液即為樣品待測液；

c、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：用甲醇配制不同濃度的α-Acr-dG和γ-Acr-dG標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；

d、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測定，吸取配制好的不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，得到線性回歸方程，對樣品待測液進(jìn)行測定，測得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量，在LC-MS/MS測定中，選取Extend-C18色譜柱，規(guī)格1.8 μm，4.6×100 mm，流動相體系選取0.01%甲酸甲醇A和10 mM乙酸銨水溶液B，梯度洗脫條件具體為：0-2 min：25% A，2-7 min：35% A，7-10 min：25% A；流速為0.38 mL/min，分析時間為10 min，進(jìn)樣量為5 μL；

串聯(lián)質(zhì)譜檢測器具體條件為：電噴霧離子源（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測正離子掃描方式；噴霧電壓：5500 V，離子源溫度：600℃，氣簾氣的量為20 psi，霧化氣為36 psi，干燥氣為46 psi，碰撞氣為9 psi，射入電壓：10 V，碰撞能：9 eV，駐留時間：100 ms；監(jiān)測離子對為α-Acr-dG：324.3→208.2定量離子對，324.3→190.1定性離子對；內(nèi)標(biāo)[¹⁵N₅]α-Acr-dG為329.2→213.2；γ-Acr-dG：324.3→208.1定量離子對，324.3→190.2定性離子對；內(nèi)標(biāo)[¹⁵N₅]γ-Acr-dG為329.2→213.1。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丙烯醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟a中的丙烯醛溶液用0.1 M的PBS溶液配制，濃度0.001-1 mM。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丙烯醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟b中所述的混合內(nèi)標(biāo)為100 ng/mL的 [¹⁵N₅]α-AcrdG 和[¹⁵N₅]γ-AcrdG。