[發明專利]一種巴豆醛?DNA加合物的測定方法

有效

• 申請號: 201610226586.2
• 申請日: 2016-04-13
• 公開（公告）號: CN105911165B
• 公開（公告）日: 2018-02-27
• 發明（設計）人: 侯宏衛;胡清源;陳歡;劉魯娟;朱貝貝;王紅娟;陳建
• 申請（專利權）人: 國家煙草質量監督檢驗中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司41110
• 代理人: 姜振東

技術領域

本發明屬于DNA樣本的理化檢驗技術領域，主要涉及DNA中1,N²-丙醇-鳥嘌呤（Propano-dG）加合物的測定技術領域，具體說是一種采用液相色譜-串聯質譜儀（LC-MS/MS）測定DNA中巴豆醛-DNA加合物的方法。

背景技術

巴豆醛是一種廣泛存在于環境基質中的污染物，如工業生產、機動車尾氣和卷煙煙氣等；巴豆醛為可疑的人類致癌物，性質較活潑，易于鳥嘌呤上的堿基發生邁克爾加成-關環反應形成環外加成產物1,N²-丙醇-鳥嘌呤（Propano-dG），該加合物可抑制DNA的合成并導致錯譯。

目前，關于DNA加合物的分析檢測方法報道的較多，主要有³²P-后標記技術、酶聯免疫技術（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC-UV）和液相色譜-串聯質譜技術（LC-MS/MS）。其中LC-MS/MS由于其較高的靈敏度和選擇性被廣泛應用于DNA加合物的檢測分析。

發明內容

本發明的目的正是基于上述現有技術狀況而采用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）技術建立的巴豆醛-DNA加合物（Propano-dG）的測定方法。該方法具有快速、準確、靈敏度高等特點，可用于DNA中巴豆醛-DNA加合物的定性定量分析。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

一種巴豆醛-DNA加合物的測定方法，即Propano-dG的測定方法，具體步驟如下：

a、巴豆醛暴露小牛胸腺DNA：取400 μg小牛胸腺DNA，加入配制好的巴豆醛溶液(巴豆醛溶液用0.1 M的PBS溶液配制，濃度0.001-1 mM)，對照組加入同等體積的PBS溶液。將上述溶液放入37℃恒溫培養箱中24 h；使用2倍體積的冰乙醇沉淀DNA并終止反應，離心去掉上清液，用70%的乙醇水清洗DNA樣品，得到的DNA團塊晾干并加入200 μL超純水復溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度計在260nm處檢測DNA的含量，對于雙鏈DNA一個吸收單位（OD）相當于50 μg/mL。

b、DNA的酶水解及純化富集：將上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl₂緩沖液（pH=7）中，向DNA溶液中加入20 μL的[¹⁵N₅]Propano-dG內標溶液和60U脫氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，隨后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U堿性磷酸酶在37℃中繼續孵育2h。水解液經Strata-X固相萃取，收集洗脫液液氮吹至干，復溶于100 μL 30%甲醇水溶液，即為樣品待測液。此過程的目的是為了使雙鏈DNA酶解成單核苷酸狀態，通過固相萃取和氮吹濃縮純化分離并富集所需的DNA加合物。所述內標為10 ng/mL的[¹⁵N₅]Propano-dG 。

c、標準工作液的配制：用甲醇配制不同濃度的Propano-dG標準工作溶液。

d、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）測定，吸取配制好的不同濃度混合標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統，得到線性回歸方程，對樣品待測液進行測定，測得分析物與內標峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。

色譜條件：Extend-C18（1.8 μm，4.6×100 mm）色譜柱，流動相體系選取A：0.01%甲酸甲醇和和B：10 mM乙酸銨水溶液，洗脫條件為梯度洗脫：0-2 min：32% A，2-7 min：42% A，7-10 min：32% A，分析時間為10 min，進樣量為5 μL。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），多反應監測正離子掃描方式；噴霧電壓：5500 V，離子源溫度：600℃，氣簾氣的量為20 psi，霧化氣為45 psi，干燥氣為50 psi，碰撞氣為9 psi，射入電壓：10 V，碰撞能：9 eV，駐留時間：150 ms。監測離子對為Propano-dG：338.3→222.1定量離子對，338.3→117.2定性離子對；內標[¹⁵N₅]Propano-dG為343.2→227.2。

本發明方法的線性范圍和檢出限：