[發(fā)明專利]一種巴豆醛?DNA加合物的測(cè)定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610226586.2
• 申請(qǐng)日: 2016-04-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105911165B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-02-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯宏衛(wèi);胡清源;陳歡;劉魯娟;朱貝貝;王紅娟;陳建
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司41110
• 代理人: 姜振東

1.一種巴豆醛-DNA加合物的測(cè)定方法，所述巴豆醛-DNA加合物是1,N²-丙醇-鳥(niǎo)嘌呤（Propano-dG），其特征在于：包括以下具體步驟：

a、巴豆醛暴露小牛胸腺DNA：取400 μg小牛胸腺DNA，加入配制好的巴豆醛溶液，對(duì)照組加入同等體積的PBS溶液；將上述溶液放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h；使用2倍體積的冰乙醇沉淀DNA并終止反應(yīng)，離心去掉上清液，用70%的乙醇水清洗DNA樣品，得到的DNA團(tuán)塊晾干并加入200 μL超純水復(fù)溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)在260nm處檢測(cè)DNA的含量，對(duì)于雙鏈DNA一個(gè)吸收單位（OD）相當(dāng)于50 μg/mL；

b、DNA的酶水解及純化富集：將上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl₂緩沖液中，向DNA溶液中加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液和60U脫氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，隨后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U堿性磷酸酶在37℃中繼續(xù)孵育2h，水解液經(jīng)Strata-X固相萃取，收集洗脫液液氮吹至干，復(fù)溶于100 μL 30%甲醇水溶液，即為樣品待測(cè)液；

c、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：用甲醇配制不同濃度的Propano-dG標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；

d、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測(cè)定，吸取配制好的不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，得到線性回歸方程，對(duì)樣品待測(cè)液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測(cè)液中分析物的含量，在LC-MS/MS測(cè)定中，選取Extend-C18色譜柱，規(guī)格1.8 μm，4.6×100 mm，流動(dòng)相體系選取0.01%甲酸甲醇A和10 mM乙酸銨水溶液B，梯度洗脫條件為：0-2 min：32% A，2-7 min：42% A，7-10 min：32% A；流速為0.40 mL/min，分析時(shí)間為10 min，進(jìn)樣量為5 μL；

串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器具體條件如下：電噴霧離子源ESI，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子掃描方式；噴霧電壓：5500 V，離子源溫度：600℃，氣簾氣的量為20 psi，霧化氣為45 psi，干燥氣為50 psi，碰撞氣為9 psi，射入電壓：10 V，碰撞能：9 eV，駐留時(shí)間：150 ms；監(jiān)測(cè)離子對(duì)為Propano-dG：338.3→222.1定量離子對(duì)，338.3→117.2定性離子對(duì)；內(nèi)標(biāo)[¹⁵N₅]Propano-dG為343.2→227.2。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴豆醛-DNA加合物的測(cè)定方法，其特征在于：步驟a中巴豆醛溶液用0.1 M的PBS溶液配制，濃度0.001-1 mM。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴豆醛-DNA加合物的測(cè)定方法，其特征在于：步驟b中所述內(nèi)標(biāo)溶液為10 ng/mL的[¹⁵N₅]Propano-dG。