[發明專利]一種乙醛?DNA加合物的測定方法

有效

• 申請號: 201610226317.6
• 申請日: 2016-04-13
• 公開（公告）號: CN105911163B
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 陳歡;侯宏衛;胡清源;劉魯娟;朱貝貝;陳建;王紅娟
• 申請（專利權）人: 國家煙草質量監督檢驗中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司41110
• 代理人: 姜振東

1.一種乙醛-DNA加合物的測定方法，所述乙醛-DNA加合物是N²-亞乙基-鳥嘌呤（Ethylidene-dG）、1,N²-丙醇-鳥嘌呤（Propano-dG），其特征在于：包括以下具體步驟：

a、乙醛暴露小牛胸腺DNA：取400 μg小牛胸腺DNA，加入配制好的乙醛溶液，對照組加入同等體積的PBS溶液，上述溶液中各加入8.0 mg的精氨酸，放入37℃恒溫培養箱中24 h；使用2倍體積的冰乙醇沉淀DNA并終止反應，離心去掉上清液，用70%的乙醇水溶液清洗DNA樣品，得到的DNA團塊晾干并加入200 μL超純水復溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度計在260nm處檢測DNA的含量，對于雙鏈DNA一個吸收單位（OD）相當于50 μg/mL；

b、DNA的酶水解及固相萃取（SPE）：將上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl₂緩沖液中，加入30 mg 的還原劑NaBH₃CN，將N²-亞乙基-鳥嘌呤（Ethylidene-dG）還原成N²-乙基-鳥嘌呤（Et-dG）來檢測，加入20 μL混合內標，加入60U脫氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，隨后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U堿性磷酸酶在37℃中繼續孵育2h，水解液經1 mL甲醇活化和1 mL超純水平衡的Strata-X固相萃取小柱，用1 mL超純水和1 mL 10%的甲醇水淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇水洗脫，收集洗脫液即為樣品待測液；

c、標準工作液的配制：用甲醇配制不同濃度的N²-乙基-鳥嘌呤（Et-dG）、1,N²-丙醇-鳥嘌呤（Propano-dG）標準工作溶液；

d、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）測定，吸取配制好的不同濃度混合標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統，得到線性回歸方程，對樣品待測液進行測定，測得分析物與內標峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量；在LC-MS/MS測定中，選取Thermo Acdiv^TM Polar Advantage II C18 色譜柱，規格4.6×150 mm，3 μm，流動相體系選取甲醇A和純水溶液B，等度洗脫條件為：0-15 min：35% A；流速為0.40 mL/min，分析時間為15 min，進樣量為5 μL；

串聯質譜檢測器條件如下：電噴霧離子源（ESI），多反應監測正離子掃描方式；噴霧電壓：5500 V，離子源溫度：550℃，氣簾氣的量為20 psi，霧化氣為70 psi， 干燥氣為75 psi，碰撞氣為9 psi，射入電壓：10 V，碰撞能：9 eV，駐留時間：200 ms；監測離子對為Et-dG：296.2→180.2定量離子對，296.2→117.2定性離子對；內標[¹⁵N₅]Et-dG為271.2→155.2；Propano-dG：338.3→222.1定量離子對，338.3→117.2定性離子對；內標[¹⁵N₅]Propano-dG為343.2→227.2。

2.根據權利要求1所述的乙醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟a中的乙醛溶液用0.1 M的PBS溶液配制，濃度0.00-1 mM。

3.根據權利要求1所述的乙醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟b中所述混合內標為100 ng/mL的[¹⁵N₅]Et-dG和[¹⁵N₅]Propano-dG。