[發明專利]一種乙醛?DNA加合物的測定方法

有效

• 申請號: 201610226317.6
• 申請日: 2016-04-13
• 公開（公告）號: CN105911163B
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 陳歡;侯宏衛;胡清源;劉魯娟;朱貝貝;陳建;王紅娟
• 申請（專利權）人: 國家煙草質量監督檢驗中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司41110
• 代理人: 姜振東

技術領域

本發明屬于DNA樣本的理化檢驗技術領域，主要涉及DNA中N²-亞乙基-鳥嘌呤（Ethylidene-dG）和1,N²-丙醇-鳥嘌呤（Propano-dG）加合物的測定技術領域，具體說是一種采用液相色譜-串聯質譜儀（LC- MS/MS）測定DNA中乙醛-DNA加合物的方法。

背景技術

乙醛是一種廣泛存在于環境基質中的污染物。主要產生于有機物的不完全燃燒，如工業生產、卷煙煙氣、機動車尾氣等?；顫姷娜┗恍枰涍^機體代謝就能夠直接攻擊生物體內親核基團，如核酸中的鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶形成DNA加合物。乙醛形成的主要DNA加合物包括N²-亞乙基-鳥嘌呤（Ethylidene-dG）和1,N²-丙醇-鳥嘌呤（Propano-dG），其中1,N²-丙醇-鳥嘌呤（Propano-dG）是由Ethylidene-dG與乙醛進一步反應所得，該過程需要氨基酸的催化。N²-亞乙基-鳥嘌呤（Ethylidene-dG）在單核苷酸狀態下不穩定，需要將其在DNA酶水解階段還原為N²-乙基-鳥嘌呤（Et-dG）才能被檢出。

目前，關于DNA加合物的分析檢測方法報道的較多，主要有³²P-后標記技術、酶聯免疫技術（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC-UV）和液相色譜-串聯質譜技術（LC-MS/MS）。其中LC-MS/MS由于其較高的靈敏度和選擇性被廣泛應用于DNA加合物的檢測分析。

發明內容

本發明的目的正是基于上述現有技術狀況而采用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）技術建立的乙醛-DNA加合物（Ethylidene-dG和Propano-dG）的測定方法。該方法具有快速、準確、靈敏度高等特點，可用于DNA中乙醛-DNA加合物的同時定性定量分析。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

一種乙醛-DNA加合物的測定方法，即DNA中Ethylidene-dG和Propano-dG的測定方法，具體步驟如下：

a、乙醛暴露小牛胸腺DNA：取400 μg小牛胸腺DNA，加入配制好的乙醛溶液（乙醛溶液用0.1 M的PBS溶液配制，濃度0.001-1 mM），對照組加入同等體積的PBS溶液。上述溶液中各加入8.0 mg的精氨酸，放入37℃恒溫培養箱中24 h；使用2倍體積的冰乙醇沉淀DNA并終止反應，離心去掉上清液，用70%的乙醇水清洗DNA樣品，得到的DNA團塊晾干并加入200 μL超純水復溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度計在260nm處檢測DNA的含量，對于雙鏈DNA一個吸收單位（OD）相當于50 μg/mL。

b、DNA的酶水解及固相萃取（SPE）：將上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl₂緩沖液（pH=7）中，加入30 mg的還原劑 NaBH₃CN，將Ethylidene-dG還原為Et-dG；加入20 μL混合內標，加入60U脫氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，隨后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U堿性磷酸酶在37℃中繼續孵育2h。水解液經1 mL甲醇活化和1 mL超純水平衡的Strata-X固相萃取小柱，用1 mL超純水和1 mL 10%的甲醇水淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇水洗脫，收集洗脫液即為樣品待測液。此過程的目的是為了使雙鏈DNA酶解成單核苷酸狀態，通過固相萃取和氮吹濃縮純化分離并富集所需的DNA加合物。所述混合內標為100 ng/mL的[¹⁵N₅]Et-dG和[¹⁵N₅]Propano-dG。

c、標準工作液的配制：用甲醇分別配制不同濃度的Et-dG和Propano-dG標準工作溶液。

d、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）測定，吸取配制好的不同濃度混合標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統，得到線性回歸方程，對樣品待測液進行測定，測得分析物與內標峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。