[發明專利]一種大鼠腦垂體細胞的分離及培養方法

在審

• 申請號: 201610225609.8
• 申請日: 2016-04-08
• 公開（公告）號: CN107267438A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 何剛;張亞洲;蔣敏;齊來俊
• 申請（專利權）人: 江蘇齊氏生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于細胞技術領域，具體涉及一種大鼠腦垂體細胞的分離及培養方法。

背景技術

腦垂體(pituitary gland)又名腦下腺，是內分泌系統的重要組成部分，位于間腦腹面，視交叉后方，與丘腦下部相連。垂體是生物體內最重要的內分泌腺。垂體前葉由促甲狀腺激素細胞、促性腺激素細胞、生長激素細胞等多種細胞構成。垂體受下丘腦和靶器官激素的雙重調節，它在機體新陳代謝，保持內環境穩定，機體的生長發育等方面均具有重要作用。體外培養垂體細胞可以被用于研究刺激促黃體素(Luteinizing hormone，LH)合成和分泌機理，促卵泡素(Follicle stimulating hormone，FSH)的分泌調節。目前國內外對于大鼠腦垂體細胞的分離與培養的研究較少，分離方法不成熟，獲得的細胞純度低，數量少。本發明旨在提供一種操作簡單、高效的獲得生長狀態好、純度高的大鼠腦垂體細胞的方法，建立一套完善可靠的大鼠腦垂體細胞體外培養技術。

發明內容

根據上述問題，本發明提供了一種大鼠腦垂體細胞的分離及培養方法，該方法操作簡單，細胞產量和成活率高，是一種較為理想的大鼠腦垂體細胞原代培養方法。可以滿足多種生理生化實驗的要求。

本發明提供的技術方案包括如下步驟：

(1)選取8d的雄性SD大鼠，腹腔注射30mg/ml的戊巴比妥鈉麻醉；

(2)將大鼠麻醉后腹面向上固定于板上，局部常規消毒，用眼科剪剪去大鼠頸部被毛，無菌條件下十字切口，取出大鼠腦垂體，將腦垂體放入預冷無菌含雙抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的鏈霉素)PBS液(濃度為0.008～0.015M，PH為7.2～7.4)中洗滌數次除去血漬，去除垂體包膜；

(3)無菌條件下，在預冷的PBS(濃度為0.008～0.015M，PH為7.2～7.4)中用眼科剪將腦垂體組織剪成1mm×1mm的碎塊；

(4)用37℃預熱的III型膠原酶結合中性酶混合消化；

(5)用含10％大鼠血清、雙抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的鏈霉素)、4～6μg/ml胰島素的DMEM/F12(1∶1)混合培養基(簡稱混合培養基)終止消化，用吸管吹打重懸，收集腦垂體細胞懸液用300～500鉬網篩過濾，所得濾液80～150g離心6分鐘，去掉上清液，保留沉淀(腦垂體細胞在沉淀中)，加入15ml的混合培養基并用吸管吹打重懸，重復上述操作3次；

(6)在細胞計數板中央放置計數專用的蓋玻片，用玻璃虹吸管吸取細胞懸液，讓虹吸管在蓋玻片上或下側的計數板凹蹧處流出懸液，至蓋玻片被細胞懸液充滿為止，置于顯微鏡下計數四角大方格內的細胞總數(四大格細胞總數/4×10⁴)。計數完成后再加入培養基將細胞密度調至1×10⁵個/ml，接種至鋪多聚賴氨酸包被的的24孔培養板中，置于37℃、5％CO₂環境中培養，5h后貼壁，2d后換體積分數為5％大鼠血清DMEM/F12(1∶1)培養基培養，4d后換體積分數2.5％大鼠血清DMEM/F12(1∶1)培養基培養，5d后換無血清培養基培養。每24h觀察細胞的生長狀況及形態變化；

(7)將培養7d的細胞經胰蛋白酶消化3～6分鐘后再300～500鉬篩網純化，300～400g離心5分鐘棄上清，所得細胞沉淀用DMEM/F12(1∶1)培養基重懸后接種于處理后的培養板中；

(8)體外培養4～5d，細胞免疫熒光鑒定。

其中，步驟(1)所選的大鼠體重150±10g，8d雄性大鼠。

其中，步驟(2)所述的PBS已4℃預冷，PBS濃度為0.01M，PH為7.2～7.4；培養皿置于冰上。

其中，步驟(4)所述消化溫度為37℃，消化過夜(16h)，消化酶混合液由1.0～2.0g/l的III型膠原酶和1.0～2.0g/l的中性酶混合并且攪勻后制得，所述兩種酶混合比例1∶1～1∶1.5。

其中，步驟(5)所述培養基為DMEM/F12(1∶1)培養基，含10％大鼠血清，含100u/ml的青霉素、100u/ml的鏈霉素的雙抗，5μg/ml的胰島素。

其中，步驟(5)所述所得腦垂體細胞懸液用400鉬網篩過濾，所得濾液100g離心6分鐘。