[發明專利]一種大鼠腦垂體細胞的分離及培養方法

在審

• 申請號: 201610225609.8
• 申請日: 2016-04-08
• 公開（公告）號: CN107267438A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 何剛;張亞洲;蔣敏;齊來俊
• 申請（專利權）人: 江蘇齊氏生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種大鼠腦垂體細胞的分離及培養方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)選取8d的雄性SD大鼠，腹腔注射30mg/ml的戊巴比妥鈉麻醉；(2)將大鼠麻醉后腹面向上固定于板上，局部常規消毒，用眼科剪剪去大鼠頸部被毛，無菌條件下十字切口，取出大鼠腦垂體，將腦垂體放入預冷無菌含雙抗PBS液中洗滌數次除去血漬，去除垂體包膜；(3)無菌條件下，在預冷的PBS中用眼科剪將腦垂體組織剪成1mm×1mm的碎塊；(4)用37℃預熱的III型膠原酶結合中性酶混合消化；(5)用含大鼠血清、雙抗、胰島素的混合培養基(簡稱混合培養基)終止消化，用吸管反復吹打，收集腦垂體細胞懸液用300～500鉬網篩過濾，所得濾液80～150g離心6分鐘，去掉上清液，加入15ml的混合培養基并用吸管吹打，重復上述操作3次；(6)用細胞計數板計數，再將細胞密度調至1×10⁵個/ml，接種至鋪多聚賴氨酸包被的的24孔培養板中，置于37℃、5％CO₂環境中培養，5h后貼壁，2d后換體積分數為5％大鼠血清DMEM/F12培養基培養，4d后換體積分數2.5％大鼠血清DMEM/F12培養基培養，5d后換無血清培養基培養，每24h觀察細胞的生長狀況及形態變化；(7)將培養7d的細胞經胰蛋白酶消化3～6分鐘后再300～500鉬篩網純化，300～400g離心5分鐘棄上清，所得細胞沉淀用培養基重懸后接種于處理后的培養板中；(8)體外培養4～5d，細胞免疫熒光鑒定。

2.根據權利要求1所述的大鼠垂體細胞的分離及培養方法，其特征在于所用預冷的PBS濃度為0.01M，PH為7.2～7.4。

3.根據權利要求1所述的大鼠垂體細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟4所述消化溫度為37℃，消化過夜(16h)，消化酶混合液由1.0～2.0g/l的III型膠原酶和1.0～2.0g/l的中性酶混合并且攪勻后制得，所述兩種酶混合比例1∶1～1∶1.5。

4.根據權利要求3所述的大鼠垂體細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟4所述消化溫度為37℃，消化過夜(16h)，消化酶混合液由1.5g/l的III型膠原酶和1.5g/l的中性酶混合并且攪勻后制得，所述兩種酶混合比例1∶1.2。

5.根據權利要求1所述的大鼠垂體細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟5所述的培養基為含10％大鼠血清、含100u/ml的青霉素和100u/ml的鏈霉素的雙抗、4～6μg/ml胰島素的DMEM/F12(1∶1)培養基。

6.根據權利要求1所述的大鼠垂體細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟5所述的網篩為400鉬，離心速度100g，每次6min。

7.根據權利要求1所述的大鼠垂體細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟6所述的培養板用3～4μg/cm²的多聚賴氨酸包被，培養條件為37℃、5％CO₂培養箱。

8.根據權利要求1所述的大鼠垂體細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟7所述的純化方法為將培養7d的細胞經胰蛋白酶消化4分鐘后，再次通過400鉬的篩網，收集濾液，300～400g離心5分鐘棄上清，重懸接種。

9.根據權利要求8所述的大鼠垂體細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟7所述的純化方法為將培養7d的細胞經胰蛋白酶消化4分鐘后，再次通過400鉬的篩網，收集濾液，350g離心5分鐘棄上清，重懸接種。