[發(fā)明專利]一種紫芽茶樹R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子CsMYB6A的基因克隆及載體構(gòu)建方法以及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610225282.4
• 申請日: 2016-04-11
• 公開（公告）號: CN105671059B
• 公開（公告）日: 2019-11-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王云生;何秀娟;王新珍;夏濤;高麗萍
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/84;A01H5/12;A01H4/00;A01H6/82
• 代理公司: 安徽匯樸律師事務(wù)所 34116
• 代理人: 劉海涵

本發(fā)明公開了一種紫芽茶樹R2R3?MYB(CsMYB6A)基因克隆及載體構(gòu)建方法以及應(yīng)用，具體涉及一種紫芽茶樹DNA片段的分離、克隆、功能驗(yàn)證及應(yīng)用，該基因調(diào)控花青素合成，能夠改變植物葉片的顏色，提高植物花青色的含量，將該基因轉(zhuǎn)化到煙草中，能使轉(zhuǎn)基因煙草葉片變紅，花青素含量明顯增加。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種紫芽茶樹R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及載體構(gòu)建方法以及應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

紫芽茶樹是一種稀有的特色茶樹資源，芽葉呈現(xiàn)紫色、紅色或紅紫色，其色澤是因其花青素含量較高所致。長期以來，紅紫色芽葉因其飲用品質(zhì)欠佳而被忽略，科技人員在選育茶樹品種和制定茶樹栽培技術(shù)措施時(shí)甚至把減少紫色芽葉作為目標(biāo)之一。但隨著紅紫芽茶樹資源創(chuàng)新利用研究的深入，其主要組分的醫(yī)學(xué)保健功能逐漸被闡明，特色紅紫芽茶樹品種的選育和高花青素茶產(chǎn)品開發(fā)利用愈來愈受人們關(guān)注，相關(guān)研究在近年得到迅速發(fā)展。

花青素(Anthocyanidin)，又稱花色素，是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬類黃酮化合物。也是植物花瓣中的主要呈色物質(zhì)，水果、蔬菜、花卉等五彩繽紛的顏色大部分與之有關(guān)。花青素存在于植物細(xì)胞的液泡中，可由葉綠素轉(zhuǎn)化而來。花青素是一種強(qiáng)有力的抗氧化劑，它能夠保護(hù)人體免受一種叫做自由基的有害物質(zhì)的損傷；花青素對癌癥、心血管和神經(jīng)性疾病預(yù)防具有重要的作用；還能夠增強(qiáng)血管彈性，改善循環(huán)系統(tǒng)和增進(jìn)皮膚的光滑度，抑制炎癥和過敏，改善關(guān)節(jié)的柔韌性。目前食品工業(yè)上所用的色素多為合成色素，幾乎都有不同程度的毒性，長期使用會危害人的健康，因此天然色素就越來越引起了科研領(lǐng)域的關(guān)注，富含花青素的食品、飲料的開發(fā)研究也就越來越受到重視。

花青素的生物合成受兩類基因調(diào)控：一類是結(jié)構(gòu)基因，編碼花青素生物合成的催化酶；另一類是轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平上參與植物顏色的形成。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是花青素生物合成途徑中調(diào)節(jié)其結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的重要環(huán)節(jié)之一。轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)構(gòu)基因啟動子的被識別順式作用元件結(jié)合，單獨(dú)或者協(xié)同調(diào)節(jié)花青素生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因，從而有效控制植物體內(nèi)花青素的合成。MYB基因是最大的植物轉(zhuǎn)錄因子家族之一，也是花青素生物合成途徑中必不可少的調(diào)節(jié)因子。MYB編碼的蛋白具有一個(gè)堿性N-端，含有1-3個(gè)保守的DNA結(jié)合域(MYB結(jié)構(gòu)域)，根據(jù)結(jié)構(gòu)域的個(gè)把MYB分為3類：一個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白(R3)、兩個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白(R2R3)、三個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白(R1R2R3)，其中R2R3結(jié)構(gòu)域MYB家族主要參與調(diào)控花青素和類黃酮生物合成途徑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種紫芽茶樹R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及載體構(gòu)建方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。

一種紫芽茶樹R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及載體構(gòu)建方法，步驟包括：

(1)設(shè)計(jì)特異引物

CsMYB6A-F：ATGGACATTGTTTGTTGT；

CsMYB6A-R：TCATTCATCACCTAACAGATCCC；

CsMYB6A-attb-F：

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGACATTGTTTGTTGT；

CsMYB6A-attb-R：

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCATTCATCACCTAACAGATCCC；

以茶樹cDNA為模板，將attB1接頭序列加至CsMYB6A基因上游引物的5′端，將attB2接頭序列加至CsMYB6A基因下游引物的5′端；