[發明專利]一種紫芽茶樹R2R3-MYB轉錄因子CsMYB6A的基因克隆及載體構建方法以及應用有效
| 申請號： | 201610225282.4 | 申請日： | 2016-04-11 |
| 公開（公告）號： | CN105671059B | 公開（公告）日： | 2019-11-05 |
| 發明（設計）人： | 王云生;何秀娟;王新珍;夏濤;高麗萍 | 申請（專利權）人： | 安徽農業大學 |
| 主分類號： | C12N15/29 | 分類號： | C12N15/29;C12N15/84;A01H5/12;A01H4/00;A01H6/82 |
| 代理公司： | 安徽匯樸律師事務所 34116 | 代理人： | 劉海涵 |
| 地址： | 230031 *** | 國省代碼： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 芽茶 r2r3 myb csmyb6a 基因 克隆 載體 構建 方法 以及 應用 | ||
1.一種紫芽茶樹R2R3-MYB轉錄因子
（1）以茶樹cDNA為模板，設計特異引物
將attB1接頭序列加至引物
（2）以測序正確的帶有序列2所示
（3）進行BP反應，水浴后轉化至Trans-T1感受態，涂布含有慶大霉素的LB固體培養基上；
（4）測序正確后提取質粒，進行LR反應；
（5）測序正確后提取質粒，然后利用電轉法將該質粒轉入根癌農桿菌EHA105，在含有壯觀霉素和卡那霉素的LB固體培養基上進行篩選，倒置培養，利用菌落PCR鑒定陽性克隆。
2.根據權利要求1所述的一種紫芽茶樹R2R3-MYB轉錄因子
3.根據權利要求2所述的一種紫芽茶樹R2R3-MYB轉錄因子
4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，茶樹cDNA提取的步驟包括：
（1）茶葉組織加等量的PVPP，用液氮研磨至細粉末；
（2）將上述粉末用槍頭轉移至離心管中，加入Fruit-mate for RNA purification，用槍頭攪拌使粉末與溶液充分混合，裂解18-22min，待裂解液呈透明狀，12000g，4℃離心5min；
（3）吸取上清液，平均分至2個離心管中，分別加入等體積的RNAiso Plus，蓋緊離心管蓋，用力震蕩，待溶液充分乳化后，室溫靜置5 min；
（4）分別加入1/5總體積量的氯仿，用力震蕩混勻，室溫靜置5 min，12000g 4℃離心15min；
（5）吸取上清轉移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置10min，12000g 4℃離心10 min；
（6）棄上清，緩慢沿離心管壁加入1 ml 75%乙醇，輕彈后，12000g 4℃離心5 min，棄上清保留沉淀，重復（6）至少3次；
（7）棄上清保留沉淀后，吸取多余的乙醇，真空干燥，加適量RNase-Free水，用RNase-Free 槍頭輕輕吹打沉淀，放在-80℃保存；
（8）用核酸定量儀檢測提取的總RNA的含量和質量。
5.一種對權利要求4所述方法的應用，其特征在于，步驟包括：
（1）取25 ml含大觀霉素和卡那霉素的LB液體培養基，接入1 ml活化后的農桿菌EHA105，28°C搖至菌液渾濁，OD值在0.6左右；
（2）4°C，5000 r/s離心20 min；
（3）棄上清，加入30 ml含19.6 mg/L的AS的1/2 MS，將沉淀攪起混勻，4°C，5000 r/s離心20min；
（4）棄上清，再次加入含AS的1/2 MS溶液，調OD值至0.6；
（5）將預培養好的葉片丟進菌液侵染15min，期間戳破葉片，以利于農桿菌通過傷口進入葉片基因組，之后將葉片放于鋪有濾紙的平皿中，干燥；
（6）將干燥后的小葉片平鋪在共培養基上，暗培養3天；
（7）共培養完成后取出葉片，用400 mg/L羧芐青霉素沖洗葉片表面菌體，反復清洗三次，最后用無菌水沖洗，吸干表面水分，置于含有25 mg/L草銨膦的生芽培養基中誘導芽的分化，期間持續用200 mg/L羧芐青霉素和400?mg/L頭孢噻肟交替使用脫菌；
（8）反復脫菌直至芽長出，取芽置于含有25 mg/L草銨膦的生根培養基中誘導生根；
（9）待生根后，移栽壯苗；
（10）對轉基因的煙草小苗提DNA進行PCR驗證；
其中所述AS具體為乙酰丁香酮。
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