[發明專利]一種奶牛隱孢子蟲的快速檢測方法及檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201610225012.3
• 申請日: 2016-04-12
• 公開（公告）號: CN105734150A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發明（設計）人: 周東輝;吳耀東;徐民俊;鄭文斌;宋慧群;朱興全
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/10
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 呂玉博

技術領域

本發明涉及一種奶牛隱孢子蟲的快速檢測方法及檢測試劑盒。

背景技術

隱孢子蟲卵廣泛的存在于環境當中，可以感染多種脊椎動物，造成不同程度的腹瀉甚至死亡。對于奶牛養殖業，隱孢子蟲病是一種重要的寄生蟲病，可引起犢牛腹瀉，抑制幼畜的生長發育,降低畜產品的產量和數量，造成飼料的大量浪費。同時奶牛糞便是重要的傳染源，威脅人類的健康。一旦感染隱孢子蟲，沒有有效的治療方法。所以建立一種快速簡便的奶牛隱孢子蟲診斷方法顯得尤為重要。

發明內容

本發明目的是針對現有技術的不足，提出一種快速簡便檢測奶牛糞便中隱孢子蟲的方法，可以實現臨床現場檢測；本發明還提供奶牛隱孢子蟲的快速檢測試劑盒。

本發明的第一個目的是提供一種奶牛隱孢子蟲的快速檢測試劑盒，所述試劑盒包括以下成分：月桂酰肌氨酸鈉水溶液，吐溫-20水溶液，引物探針混合液，PBST溶液，測流層析試紙條，RPA凍干酶和RPA反應預混液；

所述引物探針混合液中引物序列為：

上游引物：5'-CTATGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCG-3'；

下游引物：5'-biotin-CCTCCAATTGATACTTGTTAAGGGGTTTATAC-3'；

探針序列為：5'-FAM-ACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCG-THF-GCAAATTACCCAATCCT-SpacerC3-3'；

所述PBST溶液的制備方法為：將1ml的吐溫-20溶于1000mlPBS溶液中，混勻即可。

作為優選，每16μl所述引物探針混合液的制備方法為：將上游引物21pmol，下游引物21pmol，探針6pmol混合于16μl純水中。

本發明的第二個目的是提供奶牛隱孢子蟲的快速檢測方法，所述檢測方法不以疾病的診斷和治療為目的，步驟如下：

（1）將奶牛糞便溶解于裝有月桂酰肌氨酸鈉水溶液的容器中，將容器放入盛有沸水的鍋中，蓋上鍋蓋，利用沸水的余溫孵育10-20分鐘，之后在容器內加入吐溫-20，使溶液中吐溫-20的濃度約為5%-10%，得到含有隱孢子蟲DNA的樣品處理液；

（2）對樣品處理液進行重組酶聚合酶擴增；擴增時所使用的引物和探針為：

上游引物：5'-CTATGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCG-3'；

下游引物：5'-biotin-CCTCCAATTGATACTTGTTAAGGGGTTTATAC-3'；

探針為：5'-FAM-ACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCG-THF-GCAAATTACCCAATCCT-SpacerC3-3'；

（3）將擴增產物滴加到測流層析試紙條上進行檢驗，如果試紙條為兩條杠，則為隱孢子蟲陽性，如果為一條杠，則為陰性。

作為優選，步驟（1）中所述月桂酰肌氨酸鈉水溶液的質量百分比濃度為0.1%-0.2%。

作為優選，步驟（2）中所述重組酶聚合酶擴增的反應體系為：樣品處理液2μl，引物探針混合液16μl，RPA反應預混液32μl，RPA反應凍干酶一份；反應條件為：在30℃-45℃條件下反應20-30分鐘。

作為優選，步驟（3）中將擴增產物滴加到測流層析試紙條上進行檢驗的具體方法為：用無菌牙簽沾取少許擴增產物與200μlPBST溶液混合，然后沾取一滴混合液滴加到測流層析試紙條的加樣端，并將加樣端豎直浸入裝有200μlPBST溶液的離心管中，數分鐘后觀察結果；

所述PBST溶液的制備方法為：將1ml的吐溫-20溶于1000mlPBS溶液中，混勻即可。

本發明的第三個目的是提供上述試劑盒在檢測奶牛隱孢子蟲中的應用，所述檢測不以疾病的診斷和治療為目的。

作為優選，所述奶牛隱孢子蟲為感染奶牛的微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和瑞氏隱孢子蟲。

本發明的第四個目的是提供一種從奶牛糞便中提取隱孢子蟲DNA的方法，步驟如下：將奶牛糞便溶解于裝有0.1%-0.2%月桂酰肌氨酸鈉水溶液的容器中，將容器放入盛有沸水的鍋中，蓋上鍋蓋，利用沸水的余溫孵育10-20分鐘，之后在容器內加入吐溫-20，使溶液中吐溫-20的濃度為5%-10%，完成奶牛糞便中隱孢子蟲DNA的提取。